Механизмы накопления глицерина в условиях солевого стресса.

1. Уменьшение свободной диффузии. Дрожжи Z. rouxii синтезируют значительное количество глицерина и при росте в нормальных условиях, хотя и меньше, чем на среде с NaCl. В нестрессовых условиях излишнее количество глицерина выходит во внешнюю среду, чем поддерживается невысокий уровень глицерина внутри клетки [30].

Дрожжи S. cerevisiae при повышении осмотического давления среды могут накапливать высокии концентрации глицерина вплоть до молярной концентрации. При этом повышается синтез глицерина и уменьшается его выход из клетки [11]. Процесс проникновении глицерина через плазматическую мембрану может идти различными путями:

1) Будучи липорастворимым веществом, глицерин может свободно диффундировать через плазматическую мембрану клетки [33].

2) У S. cervisiae кодируемый геном FSP1 белок-канал (Fsp1p), служит для облегченной диффузии глицерина. Так как накопление глицерина начинается очень быстро при помещении клетки в условия осмотического стресса, то наиболее вероятна регуляция работы канала облегченной диффузии на белковом уровне. Однако это не исключает возможности репрессии дополнительной транскрипции FSP1 в условиях осмотического стресса [34].

Анализ аминокислотной последовательности белка Fps1p показал принадлежность этого белка к семейству белков-каналов, встречающихся у различных групп живых организмов, причем белок Fps1p (S. cerevisiae) имеет наибольшую степень гомологии с бактериальными каналами облегченной диффузии глицерина [34].

Данное семейство - это быстро растущая группа интегральных мембранных белков, найденная у различных организмов - от бактерий до человека. В целом, эти белки имеют невысокую степень гомологии друг с другом, но все они обладают шестью погруженными в мембрану доменами и строго консервативной последовательностью из 13 аминокислот. Все белки этого семейства являются каналами с различной субстратной специфичностью (некоторые облегчают диффузию глицерина, другие проводят воду или ионы) [35].

Белок Fps1p инактивируется при осмотическом шоке и быстро открывается при снятии стрессовых условий. Этот процесс может регулироваться на белковом уровне посредством фосфорилирования [36].

2. Активный транспорт глицерина. Как Z. rouxii, таки D. hansenii, и Pichia sorbitophila являются солетолерантными видами дрожжей, значительно более устойчивыми к стрессу, чем S. cerevisiae, хотя получены мутанты S. cerevisiae, способные расти на средах, содержащих 2 М NaCl [37], и даже 3 М NaCl [38, 39].Кроме того, на средах, бедных K⁺ D. hansenii ведет себя как галофильный организм [40]. При солевом стрессе в качестве природного осмотически активного соединения они, подобно S. cerevisiae, накапливают глицерин, однако обладают дополнительным механизмом его аккумуляции в клетке [32, 33].

Как известно, поглощение осмотически активных веществ из среды роста является более энергетически выгодным процессом, нежели их синтез de novo [1], а работа системы активного транспорта глицерина может вносить существенный вклад в его накопление при осмострессе. Подобные системы обнаружены у Z. rouxii [32], D. hansenii и P. sorbitophila [33], но нет никаких доказательств существования такой системы у S. cerеvisiae.

До настоящего времени неизвестно, что является движущей силой системы активного транспорта глицеринау Z. rouxii, однако некоторые данные говорят, что энергия для этого процесса поставляется градиентом Na⁺ [32].

Системы активного транспорта глицерина D. hansenii и P. sorbitophila имеют некоторые отличия. В случае D. hansenii, имеет место система активного поглощения глицерина в симпорте с ионом натрия, использующая натриевый градиент в качестве движущей силы [41]. Таким образом, способность к поглощению глицерина прямо пропорциональна концентрации Na⁺ во внешней среде. Перемещение протонов через мембрану клетки при поглощении глицерина происходит только при наличии натрия в среде.

С другой стороны, P. sorbitophila имеет систему симпорта H⁺/глицерин, работающую относительно независимо от присутствия натрия в среде [42]. Стехиометрия этого процесса отвечает переносу одного протона на одну молекулу глицерина. Аккумуляционная способность этой системы несколько выше в присутствии соли, но не наблюдается никакой линейной зависимости между максимальной скоростью поглощения и концентрацией натрия в наружной среде [33, 44].

3. Катаболизм глицерина. За утилизацию глицерина в клетке отвечают два фермента: глицеролкиназа (К.Ф. 2.7.1.30) (фосфорилирующая глицерин с образованием глицерофосфата) и митохондриальная ГФДГ (К.Ф. 1.1.99.5), катализирующая реакцию превращения глицерофосфата в ДГАФ. Гены, кодирующие эти ферменты, носят название GUT1 и GUT2, соответственно. Мутанты gut1 и gut2 не способны расти на средах с глицерином в качестве единственного источника углерода. Следует отметить, что хотя белок Gut2p имеет митохондриальную локализацию, ген GUT2 принадлежит ядерному геному [45].