Характер распределения клеток по фазам клеточного цикла

Образец	Гипо- G 1 фаза, %	G 0 / G 1 фаза, %	S фаза, %	G 2 / M фаза, %
Образец № 1
Образец № 2
Образец № 3

4.2.2. Выявление лесенки низкомолекулярных фрагментов ДНК
методом агарозного гель-электрофореза

Данный метод является скорее качественным, нежели количественным методом детекции апоптоза. Однако именно этот тест при положительном результате, в силу его высокой специфичности, позволяет однозначно показать наличие апоптоза в анализируемом образце. Фракцию низкомолекулярной ДНК получают либо путем отделения ее из лизата клеток стандартным методом, либо путем экстракции низкомолекулярных фрагментов ДНК с помощью высокосолевого буфера из интактных клеток, предварительно подвергающихся процедуре фиксации и пермеабилизации, как описано в подразделе 4.2.1. Далее полученный образец ДНК разделяют путем электрофореза в 2% агарозном геле, в результате чего, при наличии апоптоза в тестируемом образце, образуется типичная «лесенка» фрагментов ДНК с длиной, кратной примерно 160-200 парам оснований, образующихся в апоптотических клетках при межнуклеосомном разрезании нитей ДНК.

Методика

1) Проводят экстракцию низкомолекулярной ДНК из каждого образца клеток как описано в подразделе 4.2.1 (этапы 1-6).

2) К супернатанту добавляют 0,4 мкл маточного раствора РНКазы А до конечной концентрации 100 мкг/мл, аккуратно перемешивают и инкубируют на протяжении 30 мин при температуре +37^оС.

3) Добавляют 0,4 мкл маточного раствора (10 мг/мл) протеиназы К до конечной концентрации 100 мкг/мл, аккуратно перемешивают и инкубируют на протяжении 30 мин при температуре +37^оС.

4) Полученный супернатант упаривают на протяжении 25-30 мин при температуре +60ºС в вакуумном испарителе до конечного объема
10 мкл. Важно не передержать раствор ДНК, поскольку сухой осадок ДНК будет с трудом переходить в раствор.

5) Готовят 50Х буфер TAE. Для этого в 500 мл деионизированной воды растворяют 242 г основания Tris, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл 0,5 М ЭДТА (pH 8,0). Доводят объем раствора до 1 л деионизированной водой. Готовый буфер хранят при температуре +4^оС.

6) В термостойком стеклянном флаконе (или колбе) взвешивают 2 г агарозы, заливают ее 100 мл 1Х буфера TAE и плавят на кипящей водяной бане или в микроволновой печи (2-4 мин) до полного растворения (30-60 сек после закипания содержимого флакона), при этом раствор приобретает гомогенную консистенцию и равномерную, почти бесцветную, окраску. Во флакон с расплавленной агарозой добавляют утерянный во время плавки объем деионизированной воды, и охлаждают до температуры +50-60^оС.

7) К охлажденной расплавленной агарозе добавляют EB до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и содержимое флакона аккуратно перемешивают.

8) Приготовленной агарозой заливают все стыки сборной электрофорезной камеры, выдерживают 2-4 мин, после чего в камеру наливают такой объем агарозы, что бы толщина геля составляла не более 5 мм. До того, как гель застынет, в него вставляют гребенку для лунок для внесения образцов. Гребенку заглубляют на 0,5-1 мм от дна камеры.

9) Для полного застывания гель выдерживают 30-60 мин при температуре от +15^оС до +30^оС, после чего на его поверхность наливают небольшое количество 1Х буфера TAE и с большой осторожностью удаляют гребенку.

10) Готовую пластинку геля заливают 1Х буфером TAE так, чтобы буфер покрыл пластинку примерно на 1 мм. Для сохранения постоянной концентрации EB в геле (EB во время электрофореза движется к аноду) его можно добавить в буфер до конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

11) К 10 мкл сконцентрированной низкомолекулярной ДНК добавляют 2 мкл стандартного 6Х загрузочного буфера, и образцы ДНК вносят в лунки геля. В одну из лунок вносят маркеры линейного размера ДНК, которые должны перекрывать промежуток от 100 до 1000 пар оснований

12) Электрофорез проводят на протяжении ~2 часов (при длине геля около 6 см) при напряженности электрического поля 4 В/см. После завершения электрофоретического разделения фрагментов ДНК гель извлекают из камеры, изучают под трансиллюминатором и фотографируют. Характерный вид «апоптотической лесенки» фрагментов ДНК представлен на рис. 8.

Метод ДНК-комет

Метод ДНК-комет в своей основе имеет сходство с предыдущим методом. В этом случае клетки перед процедурой пермеабилизации закрепляют на стекле в тонком слое легкоплавкого агарозного геля и в лизирующем растворе фрагменты ДНК равномерно диффундируют из плотного скопления интактной ДНК, которое обозначается как «нуклеоид». При помещении препаратов в электрическое поле фрагменты ДНК смещаются по направлению к аноду, что придает «нуклеоиду» и фрагментированной ДНК вид комет. Полученные «кометы» окрашивают
ДНК-тропным красителем типа EB и исследуют визуально под флуоресцентным микроскопом. Одно из преимуществ данного метода анализа заключается в том, что для его проведения достаточно всего нескольких

Рис. 8. «Апоптотическая лесенка» фрагментов ДНК, образующихся при межнуклеосомальной фрагментации хроматина.

На дорожке 1 показаны маркеры линейного размера фрагментов ДНК фирмы UAB Fermentas (GeneRuler ^TM 100 b p DNA Ladder), на дорожке 2 – образец ДНК, выделенной из контрольных клеток, на дорожках 3-6 – образцы ДНК, выделенной из клеток, которые были обработки индуктором апоптоза (флавон) с возрастающей концентрацией.

тысяч клеток исследуемого образца. Метод ДНК-комет широко используется для изучении формирования и репарации одинарных и двойных разрывов ДНК, возникающих под действием генотоксических факторов (ионизирующей радиации, ультрафиолета, продуктов окислительного стресса и т. п.), однако он может применяться одновременно и для анализа апоптоза. Ввиду того, что при апоптозе фрагментации подвергается почти вся ДНК клеточного ядра, апоптотические кометы отличаются мелким нуклеоидом или он вообще отсутствует, а сама комета намного крупнее неапоптотической (рис. 9).

Методика

1) Растворяют 100 мг нормальной агарозы в 10 мл горячего (температура не ниже +40^оС) фосфатного буфера. На матовую поверхность тщательно вымытых и обезжиренных предметных стекол наносят по
100 мкл горячего 1%-ного раствора нормальной агарозы, накрывают покровными стеклами и выдерживают на протяжении 10-15 мин. на холоду (при температуре не выше +4^оС). Перед использованием покровное стекло аккуратно снимают.

2) В 50 мл фосфатного буфера растворяют, используя термостат или водяную баню с температурой +37^оС, 250 мг низкоплавкой агарозы.

 

Рис. 9. Метод ДНК-комет: интактные «нуклеоиды» (А), кометы, формирующиеся при частичной фрагментации ДНК (Б) и апоптотические кометы (В).

3) Готовят лизис-буфер. Для этого в 70 мл деионизированной воды растворяют 14,61 г NaCl, 0,12 г основания Tris и 3,72 г ЭДТА, добавляют 0,8 г NaOH, раствор перемешивают и оставляют на 20 мин, после чего доводят pH до 10 с помощью концентрированной HCl или NaOH. Готовый раствор хранят при температуре от +2^оС до +8^оС. Непосредственно перед использованием к раствору добавляют 1 мл 1%-ного Тритон Х -100.

4) Клетки, предназначенные для анализа, по стандартной методике отмывают в фосфатном буфере и доводят их концентрацию до 1 млн. клеток на мл. Смешивают 5-10 мкл полученной суспензии клеток с
65 мкл расплавленной при температуре +37^оС низкоплавкой агарозы, после чего полученную смесь наносят на слой нормальной агарозы на предметном стекле. Накрывают покровным стеклом, выдерживают при температуре от +2^оС до +8^оС на протяжении 3-5 мин. до застывания агарозы и снимают покровное стекло.

5) Добавляют на препарат 75 мкл низкоплавкой агарозы с температурой +37^оС, накрывают покровным стеклом, выдерживают при температуре от +2^оС до +8^оС на протяжении 3-5 мин. до застывания агарозы, после чего снимают покровное стекло.

6) Помещают препарат в свежеприготовленный охлажденный до температуры +4^оС лизис-буфер и оставляют на ночь при температуре от +2^оС до +8^оС.

7) Готовят нейтрализующий буфер c pH 7,5. Для этого в 80 мл деионизированной воды растворяют 4,85 г основания Tris, после чего объем раствора доводят до 100 мл деионизированной водой. Готовый раствор хранят при комнатной температуре.

8) Достают препарат из лизис-буфера и 3-4 раза по 5 мин отмывают в нейтрализующем буфере.

9) Готовят буфер для электрофореза (pH 12-13) из сток-растворов 200 мМ ЭДТА (14,89 г на 200 мл воды) и 10 М NaOH (200 г на 500 мл воды). Для этого к 5 мл маточного раствора ЭДТА и 30 мл маточного раствора NaOH добавляют 965 мл воды. Маточные растворы хранят две недели.

10) Помещают препарат в камеру для горизонтального электрофореза и заливают буфером для электрофореза так, чтобы он покрывал препарат (слой буфера над препаратом будет определять силу тока). Оставляют в буфере на 20 мин.

11) Электрофорез проводят на протяжении 20 мин. при напряжении электрического поля 0,75 В/см и силе тока £300 мA. Ток можно регулировать, изменяя высоту буферного раствора над препаратом, а время электрофореза подбирают с учетом плотности расположения клеток и длины комет.

12) После завершения электрофореза вынимают препарат из электрофорезной камеры и помещают на подставку для отмывки и сушки. По каплям наносят на препарат нейтрализующий буфер и оставляют его на
5 мин, после чего препарат осушают фильтровальной бумагой. Повторяют процедуру отмывки и сушки 3-4 раза.

13) Помещают препарат в 100%-ный этанол или метанол на 5 мин и высушивают на воздухе. В таком состоянии препарат можно хранить несколько суток.

14) Наносят на препарат раствор EB (1 мкг/мл), через 15 мин смывают краситель водой и накрывают покровным стеклом.

15) Исследуют и фотографируют препарат под флуоресцентным микроскопом. Так как EB возбуждается зеленым светом, а флуоресцирует красным, то для изучения полученного препарата используют набор фильтров типа набор № 10 (BP 450-490/ FT 510/ BP 515-565) при использовании флуоресцентного микроскопа ZEISS AXIO Imager. A 1 (см. рис. 9).

Метод ДНК-комет можно упростить, отказавшись от электрофореза (такая модификация метода называется «Halo assay»). В этом случае в микроскопе фрагментированная при апоптозе ДНК отдельных клеток будет выглядеть как большая равномерная зона диффузии вокруг более яркого «нуклеоида».

4.2.4. TUNEL -метод

Множественные разрывы ДНК, возникающие в процессе апоптоза, можно детектировать, пометив образующиеся при этом свободные концы нитей ДНК. Именно этот принцип лежит в основе метода TUNEL (от англ. T erminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) mediated d U TP N ick E nd L abeling).Для проведения этого анализа клетки предварительно фиксируют и пермеабилизируют. При последующем инкубировании их в растворе, содержащем экзогенную терминальную дезоксинуклеотидил трансферазу и молекулы Br - dUTP, происходит ферментативное присоединение меченных дезоксиуридинтрифосфатов к свободным концам молекул ДНК.

Встраивание Br - dUTP идентифицируется с помощью FITC -коньюги-рованных анти- Br - dUTP моноклональных антител. В апоптотических клетках из-за образования множественных разрывов в ДНК количество связавшегося флуорофора значительно превышает таковое для нормальных клеток. Различия в уровне флуоресценции, регистрируемые на проточном цитофлуориметре, позволяют разделить пул живых и гибнущих клеток в тестируемом образце. При использовании данного метода затруднено различение апоптотических и некротических клеток, поскольку в обоих случаях имеет место деградация ядерной ДНК. В качестве вспомогательных параметров могут учитываться значения прямого и бокового светорассеяния, а также количества внутриклеточной ДНК, выявляемой путем дополнительного окрашивания клеток красителем PI.

Методика

Анализ проводится с использованием набора реагентов Apo - BrDU Kit фирмы PharMingen (или его аналога) согласно методике, рекомендованной фирмой-производителем.

1) Осаждают 0,5 ´ 10⁶ клеток каждого образца в цитоцентрифуге с ускорением 1 ´ 10³ об./мин на протяжении 5 мин при температуре от +2^оС до +8^оС. Осадок клеток ресуспензируют в 1 мл холодного (около 0^оС) этанола и фиксируют на протяжении 30 мин при температуре –20^оС.

2) Зафиксированные клетки ресуспензируют в 1 мл отмывочного буфера (Wash Buffer) и осаждают в цитоцентрифуге с ускорением
1 ´ 10³ об./мин на протяжении 5 мин при температуре от +2^оС до +8^оС, супернатант удаляют. Процедуру отмывки повторяют.

3) Отмытые клетки ресуспензируют в 1 мл окрашивающего раствора (DNA - Labeling Solution), включающего в себя терминальную дезоксинуклеотидил трансферазу и Br - dUTP, и инкубируют на протяжении
60 мин при температуре +37^оС, периодически перемешивая.

4)  Помеченные клетки осаждают в цитоцентрифуге с ускорением
1 ´ 10³ об./мин на протяжении 5 мин при температуре от +2^оС до +8^оС, супернатант удаляют, а осадок клеток ресуспензируют в промывочном буфере (Rins Buffer), после чего клетки снова осаждают, супернатант удаляют. Процедуру промывки повторяют.

5) После повторной промывки клетки ресуспензируют в 200 мкл фосфатного буфера, добавляют к ним FITC -меченные анти- Br - dUTP моноклональные антитела, суспензию перемешивают и инкубируют в темноте на протяжении 30 мин при температуре от +15^оС до +30^оС.

6) К суспензии клеток дополнительно добавляют раствор, содержащий PI и РНКазу (PI / RNAase Solution), и инкубируют на протяжении 30 мин в темноте при температуре от +15^оС до +30^оС.

7) Окрашенные клетки анализируют на проточном цитофлуориметре типа FACScan с 15-мВт 488-нм аргон-неоновым лазером и двумя дискриминационными фильтрами – 515-545 нм (фильтр Fl 1 для FITC) и 564-606 нм (фильтр Fl 2 для PI). На одну пробу анализируют минимум 30000 клеток. При сборе и анализе данных следуют общим правилам обработки данных проточной цитометрии, описанным в подразделе 2.2. Характер распределения клеток по FITC -флуоресценции представлен на рис. 10. Во взятом в качестве примера случае клетки окрашивались только с помощью FITC -меченных анти- Br - dUTP моноклональных антител.

 

Рис. 10. Частотные гистограммы распределение контрольных (синяя кривая) и экспериментальных (зеленая кривая) клеток, окрашенных с помощью FITC -меченных анти- Br - dUTP моноклональных антител, по зеленой флуоресценции.

В случае с экспериментальными клетками виден дополнительный пик флуоресценции P 1, соответствующий апоптотическим клеткам. Данные воспроизведены из книги «Методы проточной цитометрии в медицинских и биологических исследованиях».

ЛИТЕРАТУРА

1. Манских, В. Н. Морфологические методы верификации и количественной оценки апоптоза / В. Н. Манских. Бюллетень сибирской медицины, 2004. № 1.

2. Методы проточной цитометрии в медицинских и биологических исследованиях / Под ред. М. П. Потапнева. Мн.: ГУ РНМБ, 2003.

3. Программированная клеточная гибель / Под ред. В. С. Новикова. С.-Пб.: Наука, 1999.

4. Apoptosis and cell proliferation. 2^nd edition / Boehringer Mannheim GmbH, 1998.

5. Apoptosis applications and glossary / Biosource International, 2002.

6. Apoptosis: Protocols and applications guide / Promega Corporation, 2004.

7. Bertho, A. L. Flow cytometry in the study of cell death / A. L. Bertho et al. Memorial Institute of Oswaldo Cruz, 2000. Vol. 95, №. 3, P 429-433

8. Danial, N. N. Bcl -2 family proteins: critical checkpoints of apoptotic cell death / N. N. Danial. Clinical Cancer Research, 2007. Vol. 13, № 24, P. 7254-7263

9. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death / S. Elmore. Toxicology and Pathology, 2007. Vol. 35, № 4, P. 495-516.

10. Frey, T. Nucleic acid dyes for detection of apoptosis in live cells / T. Frey.
Cytometry, 1995. Vol. 21, P. 265-274.

11. Gong, J. A selective procedure for DNA extraction from apoptotic cells applicable for gel electrophoresis and flow cytometry / J. Gong et. al. Analytical Biochemistry, 1994. Vol. 218, P. 314-319.

12. Liegler, T. J. Detection and quantification of live, apoptotic, and necrotic human peripheral lymphocytes by single-laser flow cytometry / T. J. Liegler et al. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 1995. Vol. 2, № 3, P. 369-376.

13. Poot, M. Detection of changes in mitochondrial function during apoptosis by simultaneous staining with multiple fluorescent dyes and correlated multiparameter flow cytometry / M. Poot, R. H. Pierce. Cytometry, 1999. Vol. 35, P. 311-317.

14. Russo, A. Apoptosis: a relevant tool for anticancer therapy / A. Russo et al.
Annals of Oncology, 2006. Vol. 17, Supplement 7.

15. Willingham, M. C. Cytochemical methods for detection of apoptosis /
M. C. Willingham. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 1999. Vol. 47, № 9,
P. 1101-1109.

16. Zhanga, A. Apoptosis – A brief review / A. Zhanga et al. Neuroembryology, 2004-05. Vol. 3, P. 47-59.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ …............................................................................................................	3
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ………………………………………………………	4
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ……………………………………………………..	5
1. ИСТОРИЯ ПРОБЛЕМЫ …………………………………………………..………	5
2. МОРФОФИЗИОЛОГИЯ ……………………………………………………...……	6
3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АПОПТОЗА …………………………...…..	7
3.1. Пусковые процессы …………………………………………………………..….	8
3.1.1. Триггер-рецепторные комплексы …………………………………………..…	8
3.1.2. Сенсоры ………………………………………………………………………....	9
3.1.3. Передача сигнала в клетке …………………………………………….………	10
3.2. Эффекторные процессы …………………………………………………………	10
3.2.1. Биохимические изменения в плазмалемме и цитоплазме……………..……..	10
3.2.2. Биохимические изменения в ядре …………………………………….………	11
4. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ АПОПТОЗА ……………………………..……..	13
4.1. Беспозвоночные …………………………………………………………….……	13
4.2. Позвоночные …………………………………………………………………..….	14
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ………………….…….	15
1. ПОЛУЧЕНИЕ ОБРАЗЦОВ КЛЕТОК ДЛЯ АНАЛИЗА …………………………	15
2. ОЦЕНКА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ПЛАЗМАЛЕММЫ ПРИ АПОПТОЗА……………………........................................	16
2.1. Оценка ассоциированных с апоптозом морфологических изменений ПМ и других структур клетки с помощью световой и фазово-контрастной микроскопии ………………………………………………...	16
2.2. Оценка ассиметричности распределения фосфатидилсеринов в ПМ с помощью Annexin V ………………………………………………………….	17
2.3. Оценка избирательной проницаемости ПМ ……………………………………	22
2.3.1. Тест на исключение трипанового синего …………………………………….	22
2.3.2. Тест с использованием флуоресцентных красителей ………………………..	24
3. ОЦЕНКА СВЯЗАННЫХ С АПОПТОЗОМ
ИЗМЕНЕНИЙ МИТОХОНДРИЙ ………………………….………..........................	27
3.1. Определение функциональной активности митохондрий …………………….	27
3.2. Оценка снижения потенциала мембраны митохондрий ………………………	29
4. ОЦЕНКА СВЯЗАННЫХ С АПОПТОЗОМ
ИЗМЕНЕНИЙ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА ………………….…………...........................	31
4.1. Анализ морфологии клеточных ядер …………………..……………………….	31
4.2. Выявление фрагментации ДНК …………...…………………………………….	32
4.2.1. Определение количественного содержания ДНК в клетках…………………	32
4.2.2. Выявление лесенки низкомолекулярных фрагментов ДНК методом агарозного гель-электрофореза ……………………………………………	34
4.2.3. Метод ДНК-комет ……………………………………………………………...	36
4.2.4. TUNEL -метод …………………………………………………………………...	39
ЛИТЕРАТУРА ……………………….…………….………………………………...	42

 

Учебное издание

 

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД
ПРИ ОЦЕНКЕ ПРОГРАММИРУЕМОЙ
ГИБЕЛИ (АПОПТОЗА) КЛЕТОК
ЧЕЛОВЕКА