С помощью проточной цитофлуориметрии

 

А) Светорассеяние

 

Образец	Регион
	R S 1			RS 2			RS 3
	%	FSC	SSC	%	FSC	SSC	%	FSC	SSC
Образец № 1
Образец № 2
Образец № 3

 

Б) Флуоресценция

 

Образец	Дискриминационный фильтр
	Fl 1		Fl 2
	%	Интенсивность флуоресценции, условные единицы	%	Интенсивность флуоресценции, условные единицы
Образец № 1
Образец № 2
Образец № 3

 

Примечания:

1) в таблице указывают частоту (в %) встречаемости клеток по каждому из образцов, принадлежащих тому или иному региону точечного графика;

2) значения FSC и SSC выражают в условных единицах интенсивности светорассеивания (как арифметическая средняя);

3) значения Fl 1 и Fl 3 выражают в условных единицах интенсивности флуоресценции (как арифметическая средняя).

4. ОЦЕНКА СВЯЗАННЫХ С АПОПТОЗОМ ИЗМЕНЕНИЙ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА

Анализ морфологии клеточных ядер

Морфологические изменения ядер являются важными признаками, используемыми для обнаружения и изучения апоптотических клеток. Для морфологического анализа ядер апоптотических клеток проводят окрашивание живых или фиксированных клеток флуоресцентными
ДНК-тропными красителями, такими как AO, EB или PI с их последующим изучением под флуоресцентным микроскопом. Методология окрашивания и анализа аналогична таковой, описанной в подразделе 2.3.2 и, как правило, совмещается с оценкой избирательной проницаемости ПМ.

Выявление фрагментации ДНК

Характерной особенностью каспаз-зависимого процесса программируемой гибели клеток является фрагментация хроматина специфическими эндонуклеазами на фрагменты длиной до нескольких десятков килобаз с последующим межнуклеосомным разрезанием хромосомальной ДНК на мелкие фрагменты с длиной, кратной примерно 160-200 парам оснований. Для регистрации этого процесса используется несколько методических подходов.

4.2.1. Определение количественного содержания ДНК
в клетках

Предлагаемый метод основан на способности небольших молекул ДНК, образующихся в результате межнуклеосомной фрагментации, выходить из клеток после их предварительной обработки фиксаторами типа этанола, обеспечивающими пермеабилизацию клеточных мембран. После фиксации клетки выдерживают в высокосолевом буфере, в который и переходят высвободившиеся фрагменты молекул ДНК. При этом количество ДНК, оставшееся в ядрах апоптотических клеток, оказывается меньшим, чем диплоидное содержание ДНК, характерное для нормальных клеток того же типа. Далее клетки окрашивают ДНК-тропным красителем типа PI, при этом количество связавшегося красителя будет пропорционально количеству содержащейся в клетке ДНК. Анализ проводят на проточном цитофлуориметре, и пул апоптотических клеток регистрируют как гипо-диплоидный пик.

Методика

1) Осаждают 2 ´ 10⁶ клеток каждого образца в цитоцентрифуге с ускорением 1 ´ 10³ об./мин на протяжении 5 мин при температуре от +2^оС до +8^оС. Осадок клеток ресуспензируют в остатках жидкости, добавляют 2 мл холодного (около 0^оС) 80% этанола и фиксируют на протяжении не менее 24 часов (но не более одной недели) при температуре –20^оС.

2) Готовят 0,2 М раствор Na ₂ HPO ₄. Для этого 1,42 г безводной соли растворяют в 50 мл деионизированной воды. Раствор хранят при температуре от +2^оС до +8^оС.

3) Готовят 0,1 М раствор лимонной кислоты. Для этого 0,96 г безводной лимонной кислоты растворяют в 50 мл деионизированной воды. Раствор хранят при температуре от +2^оС до +8^оС.

4) Готовят буфер для экстракции низкомолекулярной ДНК, содержащий 192 частей 0,2 М Na ₂ HPO ₄ и 8 частей 0,1 М лимонной кислоты. Буфер не хранят, используют свежеприготовленный.

5) После фиксации клетки осаждают в цитоцентрифуге с ускорением 1 ´ 10³ об./мин на протяжении 5 мин при температуре от +2^оС до +8^оС, этанол удаляют, к осадку клеток добавляют 50 мкл буфера для экстракции низкомолекулярной ДНК, тщательно встряхивают на вортексе и инкубируют при температуре +37ºС на протяжении 30 мин.

6) После экстракции клетки повторно встряхивают, осаждают в цитоцентрифуге с ускорением 1 ´ 10³ об./мин на протяжении 10 мин при температуре от +2^оС до +8^оС, отбирают 40 мкл супернатанта, содержащего низкомолекулярную ДНК, в отдельную пробирку Эппендорф и оставляют ее на хранение при –20^оС до проведения анализа методом агарозного гель-электрофореза.

7) Осадок клеток ресуспензируют в 1 мл фосфатного буфера, осаждают в цитоцентрифуге с ускорением 1 ´ 10³ об./мин на протяжении
5 мин при температуре от +2^оС до +8^оС, супернатант удаляют. При необходимости, клетки могут быть переведены в 70%-ный этанол и храниться до проведения анализа при –20ºС.

8) Отмытые клетки ресуспензируют в 200 мкл фосфатного буфера, добавляют 2 мкл маточного раствора PI (конечная концентрация
50 мкг/мл), 2 мкл маточного раствора (10 мг/мл) РНКазы А (конечная концентрация 100 мкг/мл) и инкубируют на протяжении 30 мин при температуре от +15^оС до +30^оС.

9) Окрашенные клетки анализируют на проточном цитофлуориметре типа FACScan с 15-мВт 488-нм аргон-неоновым лазером и дискриминационным фильтром Fl 2. На одну пробу анализируют минимум 30000 клеток.

При сборе и анализе данных следуют общим правилам обработки данных проточной цитометрии, описанным в подразделе 2.2, учитывая специфику проводимого анализа (в частности, ключевой задачей в данном случае является определение пика клеток с нормальным и со сниженным содержанием ДНК, а также оценка процентной доли клеток в каждом пике). Характер распределения клеток по показателю флуоресценции представлен на рис. 7.

Количественные результаты анализа оформляют в виде таблицы (табл. 7). Поскольку данный метод позволяет определить не только гипо-диплоидные клетки, но и оценить характер распределения остальных клеток по фазам клеточного цикла, то в таблице предлагается указать частотное распределение клеток по G ₀/ G ₁, S и G ₂/ M фазам.

 

 

 

 

Рис. 7. Частотные гистограммы распределение анализируемых образцов
контрольных (красная кривая) и экспериментальных (синяя кривая) клеток, окрашенных PI, по содержанию ДНК.

 

 

Таблица 7