Определение функциональной активности митохондрий

Установлено, что апоптотическая или некротическая гибель клетки сопровождается нарушением функциональной активности митохондрий. Хотя не всегда удается соотнести снижение митохондриальной активности с той или иной формой клеточной гибели, тем не менее, детекция таких изменений может иметь большую значимость при решении экспериментальных или диагностических задач. Одним из методов оценки митохондриальной активности является МТТ -тест, основанный на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) желтого цвета в темно-фиолетовый формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Перевод формазана в раствор с помощью подходящих органических растворителей, таких как, диметилсульфоксид или изопропанол, и последующая фотометрия позволяют точно сопоставить изменение оптической плотности раствора по отношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток.

Методика

1) Готовят маточный раствор МТТ с концентрацией 5 мг/мл. Для этого 5 мг безводной соли МТТ растворяют в 1 мл фосфатного буфера. Свежеприготовленный раствор МТТ стерилизуют фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и хранят в темноте либо при температуре +4^оС
(1-1,5 месяца), либо при –20^оС (более длительный срок хранения).

2) Изучаемые клетки культивируют в 96-луночной плоскодонной культуральной планшетке в соответствии с дизайном эксперимента или диагностической процедуры. Все варианты ставят в трех повторностях, обязательным компонентом являются контрольные клетки, культивируемые в оптимальных условиях без каких-либо воздействий.

3) При анализе в каждую тестируемую лунку 96-луночной культуральной планшетки добавляют по 10-20 мкл раствора МТТ и инкубируют на протяжении 4-х часов в темноте при температуре +37^оС во влажной атмосфере с 5% CO ₂.

4) После завершения инкубационного периода из планшетки как можно более полно удаляют супернатант, в каждую тестируемую лунку добавляют по 200 мкл диметилсульфоксида, содержимое лунок тщательно пипетируют и инкубируют ещё 15 мин в темноте при температуре от +2^оС до +8^оС.

5) Показания оптической плотности (ОП) (в условных единицах) считывают на планшетном спектрофотометре типа Multiscan Ascent при λ = 492 нм.

6) Жизнеспособность клеток (как интегральный показатель, включающий и митохондриальную активность) рассчитывают по следующей формуле:

жизнеспособность, % = (ОП_Э / ОП_К) × 100%,                                                   (3)

где ОП_Э обозначает оптическую плотность в экспериментальных пробах (клетки, подвергшиеся экспериментальному воздействию), а ОП_К – в контрольных пробах (клетки, культивированные в оптимальных условиях без какого-либо воздействия).

Полученные результаты оформляют в виде таблицы (табл. 5).

Таблица 5

Оценка жизнеспособности клеток с помощью MTT -теста

Образец	ОП при l = 492 нм	Жизнеспособность клеток, %
Образец № 1
Образец № 2
Образец № 3

 

3.2. Оценка снижения потенциала
мембраны митохондрий

Существует ряд витальных флуоресцентных красителей катионного типа, таких как мероцианин 540, родамин 123 или 5,5’,6,6’-тетрахлоро-1,1’,3,3’-тетраэтилбензимидазолкарбоцианина иодид (JC -1), которые имеют повышенное сродство к митохондриям и накапливаются в межмембранном пространстве при наличии на внешней мембране митохондрий высокого отрицательного потенциала. При снижении этого потенциала при гибели клеток сродство красителей к митохондриям падает, что выражается в более слабом сигнале флуоресценции. Это явление используют для выявления апоптоза методами проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии. Следует отметить, что использование только лишь критерия снижения потенциала мембраны митохондрий не позволит осуществить разделение апоптотических и некротических клеток. Отчасти эта проблема может быть решена одновременным окрашиванием клеток флуоресцентным красителем на потенциал митохондриальной мембраны и PI, однако такой подход приемлем не для всех митохондриальных красителей (см. спектральные свойства, описанные ниже для такого красителя, как JC -1).

Методика

1) Осаждают 2-5 ´ 10⁵ клеток каждого образца в цитоцентрифуге с ускорением 1 ´ 10³ об./мин на протяжении 5 мин при температуре от +2^оС до +8^оС. Осадок клеток ресуспензируют в 200 мкл фосфатного буфера, имеющего температуру от +15^оС до +30^оС.

2) К клеточной суспензии добавляют краситель JC -1 до конечной концентрации 1 мкМ и клетки инкубируют в течение 15 мин в темноте при температуре от +15^оС до +30^оС. Краситель JC -1, в отличие от других катионных зондов (например, родамина 123), имеет некоторые преимущества, в частности, он обладает более высокой тропностью к митохондриальной мембране, чем к ПМ, и большей чувствительностью к изменению ее потенциала.

3) После окрашивания к клеткам добавляют фосфатный буфер до конечного объема 1 мл, клетки ресуспензируют, после чего осаждают в цитоцентрифуге с ускорением 1 ´ 10³ об./мин на протяжении 5 мин при температуре от +2^оС до +8^оС.

4) Супернатант сливают, а осадок клеток ресуспензируют в 200 мкл фосфатного буфера, имеющего температуру от +15^оС до +30^оС и анализируют на проточном цитофлуориметре.

5) Аналитическую цитометрию проводят на проточном цитофлуориметре типа FACScan с 15-мВт 488-нм аргон-неоновым лазером и двумя дискриминационными фильтрами – 515-545 нм (фильтр Fl 1 для мономерной формы JC -1) и 564-606 нм (фильтр Fl 2 для агрегированной формы
J C -1). На одну пробу анализируют минимум 30000 клеток. При сборе и анализе данных следуют общим правилам обработки данных проточной цитометрии, описанным в подразделе 2.2. Характер распределения контрольных клеток по флуоресценции представлен на рис. 6А, а экспериментальных, подвергшихся проапоптотическому воздействию – на рис. 6Б. Количественные результаты анализа оформляют в виде таблиц (табл. 6).

 

А                                                             Б

 

 

 

Рис. 6. Распределение окрашенных JC -1 контрольных (А) и экспериментальных (Б) клеток по показателям флуоресценции.

Регион R 1 соответствует клеткам с нормальным потенциалом митохондриальной мембраны, а регион R 2 – со сниженным. Данные воспроизведены из книги «Методы проточной цитометрии в медицинских и биологических исследованиях / Под ред.
М. П. Потапнева. – Минск.: ГУ РНМБ, 2003»

При использовании JC -1 в качестве флуоресцентного зонда на потенциал митохондриальной мембраны следует учитывать, что после возбуждения 488-нм аргон-неоновым лазером мономерная форма JC -1 (в этой форме краситель существует при невысокой концентрации) флуоресцирует с l = 527 нм, увеличение же концентрации JC -1 выше некоторого значения приводит к образованию агрегатов красителя с эмиссией при
l = 590 нм. В момент деполяризации митохондриальной мембраны наблюдается уменьшение соотношения интенсивности флуоресцентного сигнала при 590 нм (Fl 2) к интенсивности флуоресценции при 527 нм (Fl 1).

 

Таблица 6

Количественный анализ клеток, окрашенных JC -1,