Биохимические изменения в ядре

Основным процессом, происходящим в клеточном ядре при апоптозе, является деградация хроматина. Она осуществляется путем сочетанного воздействия на хроматин специфических для апоптоза ферментов. Белки хроматина при этом расщепляются цистеиновыми протеазами – каспазами, тогда как ДНК разрезается на фрагменты под действием эндогенных ДНКаз.

При запуске апоптоза через триггер-рецепторные комплексы Fas и TNF -a важная роль принадлежит каспазе, которая является продуктом гена ice. Первоначально она была идентифицирована как цистеиновая протеаза, расщепляющая предшественник интерлейкина-1b. Эктопическая экспрессия или гиперэкспрессия этой каспазы индуцирует апоптоз, тогда как белок вируса осповакцины CrmA и другие ингибиторы ICE блокируют его. ICE синтезируется в виде неактивного предшественника с молекулярной массой 45 кД, который превращается в субъединицы р 10 и р 20. Активный фермент представляет собой тетрамер, содержащий по две копии каждой субъединицы, который атакует пептидную связь после аспарагиновой кислоты.

К настоящему времени обнаружено более 10 различных каспаз, структурно и функционально близких ICE. Субстратами для них являются сами каспазы, ламины, топоизомеразы I и II, гистон H1 и другие компоненты хроматина. В частности, каспаза CPP 32, активируемая белком ICE, подавляет функцию поли(AДФ-рибоза) полимеразы – фермента, который участвует в репарации, катализируя образование полимеров
АДФ-рибоза в разрывах ДНК. Одновременно CPP 32 активирует ДНКазу CAD, которая разрезает ДНК между нуклеосомами. Субстратом для другой протеазы, каспазы-6, является ламин А.

Предполагается, что кроме цистеиновых в эффекторных механизмах апоптоза могут быть задействованы сериновые протеазы. Например в цитолизе, вызванном цитотоксическими лимфоцитами или естественными киллерами, участвует сериновая протеаза гранзим В/фрагментин. Она содержится в секреторных гранулах эффекторных клеток и, попадая в клетки-мишени, индуцирует фрагментацию ДНК.

Расщепление ядерной ДНК рассматривается как ключевое событие апоптоза, после которого процесс клеточной гибели становится необратимым. При этом сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК размером 50-300 килобаз, что соответствует петельным доменам хроматина. Позднее величина образующихся фрагментов сокращается до 160-200 пар оснований, что соответствует длине ДНК в составе нуклеосомы. Эти фрагменты ДНК выявляются при электрофорезе в виде полос моно- и мультимеров. Фрагментация ДНК при апоптозе представляет собой активный процесс, требующий затрат энергии и синтеза РНК и белка.

В расщеплении ядерной ДНК участвуют CAD, ДНКазы I и II, а также апоптоз-активирующий фактор АИФ. Наибольшее значение из них имеет CAD / DFF 40. Активность CAD зависит от кальция и магния и подавляется ионами цинка и специфическим ингибитором – ауринтрикарбоновой кислотой. Имеются данные, что ионы магния необходимы для образования более крупных фрагментов ДНК, тогда как добавление ионов кальция форсирует межнуклеосомное расщепление. По другим сведениям CAD обеспечивает только межнуклеосомную фрагментацию, а в нарезании крупных фрагментов ДНК участвуют другие нуклеазы, в частности АИФ.

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ АПОПТОЗА

Существуют две альтернативные точки зрения на генетический контроль апоптоза. Согласно первой из них апоптоз представляет собой вариант реализации генетических программ пролиферации и дифференцировки клетки. Об этом, в частности, свидетельствует участие в апоптозе серин-треониновой киназы Akt, фактора транскрипции NF - kB, протоонкогена
c - myc и других регуляторов клеточного цикла. Согласно другой апоптоз имеет собственную генетическую программу и механизм ее реализации.

Беспозвоночные

Доказательства участия специфических генов в апоптозе были впервые получены при исследовании нематоды Caenorhabditis elegans. Эмбриогенез этой нематоды жестко детерминирован и почти не имеет индивидуальных различий. Оплодотворенное яйцо развивается в личинку, состоящую из 550 клеток. Во время постэмбрионального развития число клеток возрастает до 1025 у самцов и до 961 у гермафродитных особей.

Развитие нематоды сопровождается гибелью 131 клетки. Генетический анализ мутантов позволил идентифицировать 14 генов, контролирующих гибель этих клеток. Гены программируемой клеточной гибели подразделяют на следующие функциональные группы:

· выбор гибели: активатор ces -1, ингибиторы ces -2 и egl -1;

· реализация гибели: активаторы ced -3 и ced -4, ингибитор ced -9;

· контроль фагоцитоза: семь других генов серии ced;

· деградация клетки: nuc -1.

Непосредственно в апоптозе клеток нематоды участвуют гены ced -3, ced -4, ced -9и nuc -1. Продуктом ced -3 является цистеиновая протеаза, а ced -4кодирует белок, связанный с N -концом продукта ced -9. Мутации генов ced -3 и ced -4 обеспечивают выживание клеток, запрограммированных на апоптоз. Ген ced -9 кодирует белок, который предотвращает гибель клеток со включенными генами ced -3 и ced -4. Развитие личинок, мутантных по ced -9, прекращается на ранних стадиях из-за массовой гибели клеток. Продукт гена nuc -1 представляет собой эндонуклеазу, которая расщепляет ДНК в мертвых клетках. Клетки, мутантные по nuc -1, погибают без расщепления ДНК.

Наиболее общей схемой последовательности событий при запуске программы апоптоза у нематоды является следующая цепочка взаимодействий: диссоциация комплекса ced -4/ ced -9, процессинг и активация ced -9, активация ced -3, перемещение ced -3 из цитоплазмы в ядро, активация nuc -1.

Позвоночные

У позвоночных животных (обычно исследуются клетки млекопитающих) описаны два семейства генов, гомологичных генам ced -9 и
ced -3 C. elegans. Гомологом ced -9 у млекопитающих является ген bcl -2, который был обнаружен при хромосомной перестройке в В-клеточной фолликулярной лимфоме. Трансфекция bcl -2 предотвращает апоптоз многих клеточных линий, в том числе и при активации через комплексы Fas и TNF -a. Продуктом bcl -2 является белок с молекулярной массой
26 кД, который называют «фактором выживания». Он встроен в мембраны митохондрий, плазматической сети и нуклеолеммы. Предполагается, что функция этого белка состоит в регуляции работы кальциевых насосов.

В последнее время у млекопитающих обнаружен еще ряд генов, гомологичных ced -9, которые объединены в семейство ced -9/ bcl -2. Их продуктами являются как промоторы апоптоза (Bax, Bak, Nbk / Bik 1, Bad, Bcl - xS), так и его ингибиторы (Bcl -2, Bcl - xL, Mcl -1, Bcl - w, ced -9 и другие). Члены семейства взаимодействуют между собой, формируя гомо- и гетеродимеры, причем баланс ингибиторов и промоторов определяет судьбу клетки.

Продукт гена ced -3, который участвует в апоптозе у C. elegans, гомологичен цистеиновой протеазе ICE млекопитающих. В клетках млекопитающих при апоптозе можно зарегистрировать увеличение активности еще целого ряда цистеиновых протеаз (NEDD -2/ Ich -1, ICErel -III, Mch -2, CPP 32 и др.), которые обладают структурным и функциональным сходством с ICE. В последнее время их объединяют под общим названием «каспазы» и рассматривают как основное звено сигнального пути Fas / TNF -a. Белок вируса осповакцины CrmA и белок бакуловируса p 35, которые способны связываться с этими ферментами и блокировать их, подавляют апоптоз в самых различных клеточных системах.

Таким образом, последовательность рецептор Fas / ICE / CPP 32/ CAD рассматривается в настоящее время как основной путь реализации генетической программы апоптоза у млекопитающих. Следует, однако, отметить, что при индукции апоптоза глюкокортикоидами, радиацией или ультрафиолетовым светом могут, по-видимому, использоваться и другие сигнальные пути.