Одномоментная, однопробирочная проба на осмотическую резистентность

При появлении подозрения на ГП необходимо провести скрининговое исследование при помощи одномоментной, однопробирочной пробы на осмотическую резистентность. Данная проба дает положительную реакцию в основном при талассемиях. Однако в тех регионах, где распространены оба заболевания - и СКБ и талассемий она может оказаться исключительно полезной, указывая на возможность смешанных форм. Мы пользуемся ею уже более 30 лет и она дает вполне удовлетворительные результаты ориентировочного выявления гемоглобинопатии. Проба проста, легко выполнима, доступна для любой лаборатории.

Ниже приводится методика и техника ее проведения:

Реактивы:

1. Основной 10% раствор с рН-7,4:

62

NaCl                                     - 90 г.

Na₂HPO₄                            -136,65 г,

NaH₂P0₄xH₂0₂                 -2,43 г.

Дистиллированная вода до 1000 мл.

2. Рабочий 0,35% раствор. Готовится разведением 35 мл основного 10% раствора в 1000 мл дистиллированной воды.

Ход определения: в меланжер для эритроцитов до метки 1 набирают кровь из пальца и до метки 101 -0,35% рабочий раствор. Меланжер осторожно встряхивают и оставляют на 20 минут.

Учет результатов однопробирочной пробы на ОРЭ: в норме в рабочем 0,35% растворе разрушается 90% эритроцитов, и раствор становится совершенно прозрачным. При талассемиях эритроциты осморезистентны и большая часть их в этом растворе не гемолизируется, поэтому раствор остается мутным, т.е. ОРЭ будет положительной.

Результаты оцениваются по степени мутности раствора в ампуле меланжера по трехбальной системе «-» реакция отрицательная; «+» реакция слабо положительная (сомнительная) и «++» реакция положительная. Ниже приводятся критерии для этих оценок.

"-" - раствор в ампуле меланжера совершенно прозрачный (через широкую часть ампулы меланжера можно свободно читать текст газеты - осмотическая резистентность нормальная).

"+" - раствор в ампуле мутный (даже крупный газетный текст читается с трудом - более 20-30% эритроцитов негемолизнрованно - проба сомнительна) "++" - раствор очень мутный (текст прочесть невозможно - осмотически устойчивых эритроцитов более 30% - проба положительна).

Одномоментная проба отражает повышение осмотической резистентности эритроцитов, что объясняется наличием в крови большого количества молодых клеток, в частности, ретикулоцитов. Эти молодые клетки проявляют большую устойчивость к лизису по мере понижения концентрации NaCl, вследствии чего эритроциты дольше сохраняются в растворе.

Данная проба проста, удобна и не требует много времени для выполнения. В то же время, наш большой опыт работы с ней свидетельствует о ее достаточной специфичности и чувствительности для ориентировочного выявления гемоглобинопатии, в частности и СКБ.

При положительной однопробирочной пробе и обнаружении в периферической крови мишеневидных и необратимо серповидных эритроцитов проводится метабисульфитная проба, выявляющая серповидные эритроциты.

63

МЕТАБИСУЛЬФИТНЫЙ ТЕСТ

Данный тест выполняется по несколько модифицированной методике, описанной в руководстве A. Simmons a (169). Кровь для этой пробы берут из пальца после предварительной перетяжки его резинкой втечение 5 минут.

На предметном стекле смешивают каплю крови с каплей свежего водного 2% раствора метабисульфита натрия (NajS₂0₅) и накрывают покровным стеклом, которое обводят вазелином для предотвращения доступа кислорода. Препарат рассматривают под микроскопом при увеличении в 400 раз в течение первых 10-15 мин., затем через 24 и 48 часов, хотя, как правило, интенсивная серповидность выявляется уже через 2-6 часов. В случае положительного результата эритроциты принимают серповидную форму (рисунки 3, 8,13, 17, 19,21).

Рис. 13. Метаб и сульфитная проба при серповидно-клеточной анемии. Все эритроциты стали серповидными. Окуляр 7, объектив 90 (собственные оригинальный препарат и фото).

При положительности метабисульфитной пробы диагноз СКВ становится достоверным. Однако для опрделения степени нарушения соотношений гемоглобинов и еще более точного подтверждения наличия HbS производится электрофорез.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ГЕМОГЛОБИНА

Разделение НЬ, содержащихся в крови человека, производится путем электрофореза. Существуют различные методики и аппараты. Мы пользуемся электрофорезом на ацетатцеллюлозных пленках с помощью прибора, сконструированного СКВ БФА в 1973 г., модель ЭФЛА 250-0,05. Режим работы разработан и рекомендован СКВ БФА.

Ниже приводится методика проведения электрофореза.

64

Реактивы:

1. Трис-буфер для электродов (рН-9,0): борная кислота - 0,92 г; трис-трисгидрометиламинометан-12 г; ЕДТА(этилендиаминочетырехуксусная кислота) - 1,56 г; дистиллированная вода до 1000 мл.

2. Красящий раствор: амндошварц - 1г; сульфатсалициловая кислота -3 г; трихлоруксусная кислота - 3 г; дистиллированная вода - 100 мл.

3. Отмывающий раствор: метиловый спирт - 50 мл; ледяная уксусная кислота - 10 мл; дистиллированная вода - 40 мл.

Ход определения: камеру заливают буфером до одинакового уровня в кювете. Любую хроматографическую бумагу, смоченную буфером, накладывают в два слоя на края рамки, и концы ее опускают в буфер.

Пленки из ацетатцеллюлозы размером 25х 120 мм, смоченные в буфере, слегка промокают фильтровальной бумагой и помещают в камеру матовой поверхностью вверх на края рамок, покрытых бумажными мостиками. На каждую полоску наносят прямой линией 0,005 мл раствора гемолизата (см, методику приготовления гемолизата ниже), содержащего 8-10% НЬ. Для нанесения используют кисточку или специально сделанный штамп. Камеру закрывают крышкой и подключают к выпрямителю тока для электрофореза типа ПВ Эф-1. Разделение проводят при силе тока 1 mА на 1 пленку в течение 2-х часов при напряжении 250 вольт. Пленки красят в течение 10 мин. с последующим многократным (4-5 раз) промыванием в отмывающем растворе, а затем в воде (отмывание проводят до получения белого фона). После отмывки пленки высушивают фильтровальной бумагой.

Получаемые при этом фракции НЬ представлены на рис. 14, 18 и 20.

Рис. 14. Электрофорез НЬ на ацетатцеллюлозной пленке. Верхняя фореграмма - донор; нижняя - больной СКВ. Обозначения: 1. Точка отсчета-места нанесения гемолизата. 2. Малая фракция взрослого НЬ - НЬА₂ 3. HbS. 4. HbA.

Гетерозиготный пациент (собственные оригинальная Э-фореграмма и фото).

65

У здоровых людей на электрофорефамме выявляется также HbF- между А₂ и А, ближе к последнему У больных СКБ HbF располагается между HbS и А. Все это затрудняет определение количества HbF по апектрофореграммам, поэтому обычно его определяют по методу Бетке (см. ниже).

Количественное определение гемоглобиновых фракций проводится путем элюирования окрашенных фракций. Окрашенную ацетатцеллюлез-ную пленку разрезают на зоны, соответствующие фракциям НвА, НвА,, HbS, видимые на глаз и помещают в пробирки, содержащие 20 и 4 мл элюи-рующего раствора и элюируют в течение 30 минут.

Для элюирования применяют 2% раствор двууглекислого натрия (Na₂CO₃) в 50% этиловом спирте.

Полученные при элюировании растворы фотометрируют на спектрофотометре (СФ 16) против элюирующего раствора или воды при длине волны 615 ммк. Количество НЬА₂ вычисляют по формуле: Е 615 ммк НЬ2 х 100, а А - Е 615 ммк НЬА2 + 5 х (Е 615 ммк НЬА), где Е - оптическая плотность.

Приготовление гемолизатов проводится следующим образом: берется венозная кровь с антикоагулянтом. В качестве антикоагулянта используется нефракционированный гепарин (1-2 капли на 4 мл крови). Кровь центрифугируют от 3 до 5 мин. и надосадочный слой отсасывают пипеткой. Оставшиеся в пробирке эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором с последующим центрифугированием и удалением верхнего слоя. Отмытые эритроциты лизируют добавлением равного объема воды и 0,5 объема четыреххлористого углерода: пробирки энергично встряхивают в течение 10 мин., после чего смесь центрифугируют 40-50 мин. при 5-ти тысячах оборотов в минуту. Потом надосадочный прозрачный гемолизат осторожно переносят пипеткой в другую пробирку, в которой он может храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение нескольких месяцев.