Генетически модифицированные антитела

 

Способность антител находить свои мишени и связываться с ними сделало их идеальными кандидатами для разных видов терапии. Например, можно пришить к антителу, узнающему опухолевый антиген, хемотерапевтическое лекарство или радиоактивную метку, и ввести пациенту; он будет таким образом избавлен от многих побочных эффектов традиционной химио- и радиотерапии. Однако, антитела, получаемые из клеток животных, узнаются нашей иммунной системой как чужеродные объекты, и уничтожаются. С помощью технологии рекомбинантной ДНК можно получить антитела, которые человеческая иммунная система считает «своими» и которые можно использовать для лечения людей. (например, герцептин – это препарат на основе модифицированных антител, чрезвычайно эффективный при лечении определенных форм рака груди).

Использование технологий генной инженерии для получения антител также избавляет нас от необходимости убивать лабораторных животных. Ниже описаны два способа получения генно-модифицированных антител к определенному антигену.

 

Иммортализация гибридомы

 

С помощью технологии рекомбинантной ДНК можно переместить антиген-узнающий участок из известного мышиного моноклонального антитела на человеческое антитело, соединив часть мышиного гена с человеческим. Затем достаточно трансформировать этой ДНК бактерии и можно получать антитела в неограниченном количестве, причем культивировать бактерии гораздо легче и дешевле, чем клетки мышей.

 

Фаговый дисплей

 

Это современный метод получения новых антител к интересующим нам антигенам. Для этого антиген-узнающие участки миллиарды генов, кодирующих антитела из миллиардов B клеток помещаются в геномы фага лямбда (бактериофаги, или фаги, это вирусы бактерий; фаг лямбда это один из таких вирусов). Генно-модифицированные фаги экспонируют на своей поверхности антиген-узнающие участки человеческих антител. Полученная фаговая библиотека подвергается скринингу для того,чтобы найти фагов, связывающихся с данным антигеном. Этих фагов для некоторых экспериментов можно использовать непосредственно вместо антител или же можно соединить участок ДНК из фага с геном, кодирующим человеческое антитело, трансформировать полученной рекомбинантной ДНК бактерии и получить большие количества антител, пригодных для применения в медицине. Фаговый дисплей – это на сегодняшний день последнее слово в иммунотерапии.

 

Мечение и обнаружение антител

 

Антитела используются в диагностике и научных исследованиях как средства для специфического мечения. Чтобы сделать метку видимой, антитела ковалентно пришивают (конъюгируют) к молекулам, которые можно легко обнаружить. Например, флуоресцентно меченное антитело позволяет вам локализовать антиген в клетке с использованием флуоресцентного микроскопа. Антитела также пришивают к ферментам, которые реагируют с различными субстратами с образованием окрашенных соединений, таким образом, окраска развивается только там, где присутствует антитело, и ее степень зависит от количества молекул конъюгированного с ферментом антитела. Связанные с ферментами антитела обычно используется в микроскопии, для вестерн-блотов (см. ниже) и в ИФА.

Мишени антител, или антигены, можно обнаружить непосредственно, пометив специфичные к данному антигену антитела.

 

Прямое обнаружение антител

Тем не менее, метить каждый вид антител, который может быть использован, дорого и сложно, поэтому более обычный метод визуализации антигена – это непрямое наблюдение, основанное на использовании поликлональных вторичных антител. Вторичные антитела узнают первичные антитела, полученные из определенного животного, при этом неважно, какая у первичных антител антигенная специфичность. Таким образом, первичные антитела специфично узнают и связывают антиген, а вторичные антитела узнают и связывают первичные антитела. При этом для обнаружения всех возможных видов первичных антител, полученных в одном животном, например, в кролике, достаточно одного вида меченых вторичных антител. У этого метода есть еще одно преимущество: вторичные антитела узнают множество отдельных эпитопов на поверхности первичных антител, и с одной молекулой первичного антитела может связаться сразу несколько молекул меченого вторичного антитела, усиливая сигнал.

 

Непрямое обнаружение антител

Для получения вторичных антител, антитела из одного вида животных вводят другим животным. Например, если первичное антитело – это мышиное моноклональное антитело, для получения вторичных антител достаточно иммунизировать козу любым мышиным антителом. Затем козьи поликлональные анти-мышиные антитела выделяются из козьей сыворотки и сшиваются с ферментом. Вторичные антитела широко коммерчески доступны, как немеченые, так и с самыми разными химическими и ферментативными метками.

 

Использование антител

 

Антитела использовались на протяжении десятилетий как средство исследования, но в последние годы развитие технологий производства антител сделало возможным их применение во множестве новых областей. Основа всех иммунологических технологий - необычайная специфичность связывания антител и антигенов. Вот несколько примеров:

 

Иммуноокрашивание это способ локализации антигенов в органеллах, клетках, тканях, отдельных организмах и также способ отличить одну клетку от другой. Например, раковые клетки часто выглядит неотличимо от обычных под микроскопам, но при использовании иммуноокрашивания выявляются существующие различия в количестве и в видах находящихся на поверхности клеток белков (антигенов). Изучение этой информации помогает диагностировать рак и понять свойства раковых клеток.

С помощью иммуноокрашивание тканей или организмов можно узнать в каком типе клеток обычно находится интересующий нас белок, что в свою очередь помогает нам понять функцию этого белка. Например, иммуноокрашивание семян на разных стадиях созревания позволяет нам следить за количеством и расположением молекул белка по мере роста растения. Антитела для иммуноокрашивания конъюгированы с флуоресцентными молекулами, или с ферментами, которые катализируют образование окрашенных веществ.

Специальным приложением иммуноокрашивания является сортировка клеток. При этом процессе популяция клеток окрашивается флуоресцентно меченым антителом и физически разделяется на меченые и немеченые клетки. Клеточный сортер использует лазер для того,чтобы «считать» флуоресцентную метку и электростатический заряд, чтобы разделить клетки в растворе. Он способен разделять до 30 000 клеток в секунду!

 

Иммуноблоттинг, или вестерн-блоттинг говорит о присутствии белка, его размерах и относительном количестве в данном образце (образец может представлять из себя сложную смесь белков, обычно это лизат клеток). Для осуществления блоттинга, белки, разделенные по размеру в полиакриламидном геле, под действием тока переносятся на нейлоновую или нитроцеллюлозную мембрану. Далее мембрана инкубируется с первичным антителом к интересующему исследователя белку, затем с конъюгированными с ферментом вторичными антителами. Окисляя хромогенный субстрат, фермент образует на мембране окрашенную полосу, или же, фермент может вызывать образование света (хемилюминисцентный субстрат), который вызывает образование засвеченной полосы на фотопленке. Размер белка определяется, сравнивая положение визуализированной полосы с маркерными белками известной массы, прогнанными на том же геле. Количество белка определяется по сравнению интенсивности полосы с интенсивностью маркерных полос.

Одной из модификацией вестерн-блоттинга является дот-блоттинг. При этом образец белка сразу капается на мембрану. Дот-блоттинг используется для быстрого скрининга большого числа образцов. На мембрану может быть одновременно нанесено много образцов, поэтому этот метод позволяет быстро определить, где присутствует определенный белок, но он не предоставляет никакой информации о размере изучаемого белка.

 

Существует большое количество тест-полосок, или иммунохроматографических тестов. Есть тесты на беременность, на разные наркотики, инфекционные агенты (например на ВИЧ, чуму, E. coli O157:H7 и Legionella), даже на никотин и алкоголь. Эти тесты дают положительный или отрицательный ответ в течение минут. Они основаны на использовании многих антител, одно из которых обычно мечено окрашенным соединением, например коллоидным золотом. Накопление таких антител в определенной зоне вызывает появление там розовой полосы. Например, домашние тесты на беременность детектируют человеческий хорионный гонадотропин (ХГЧ) – гормон, который появляется в крови и моче беременной женщины через несколько дней после оплодотворения. Ближе к нижнему краю на тестовую полоску нанесены мышиные моноклональные антитела к ХГЧ, связанные с розовым коллоидным золотом(шаг 1). После того, как нижний край полоски погружается в мочу, жидкость начинает подниматься наверх под действием капиллярной силы, вместе с ней перемещаются и антитела. Если в моче содержится ХГЧ, он связывается с антителами (шаг 2). Когда комллексы достигают первой тестовой зоны, они связываются с антителами к ХГЧ, фиксированными на полоске, и концентрируются в виде розовой полосы (шаг 3). На полоске всегда есть внутренний контроль в виде фиксированных козьих поликлональных антимышиных антител (узнающих антитела к ХГЧ как связанные, так и не связанные с антигеном) (шаг 4). Таким образом, любой работающий тест дает одну розовую полосу, но только при положительном результате теста можно увидеть две полосы.

 

 

Приложение Б: Словарь терминов

 

3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ): растворимый колориметрический субстрат, окисляемый пероксидазой хрена в вещество, имеющее синюю окраску. Часто используется в ИФА.

 

 

Антиген: любое вещество, которое связывается антителами или Т-клетками и способно вызвать специфический иммунный ответ.

 

Антитело: белок (иммуноглобулин), синтезирующийся клетками иммунной системы в ответ на столкновение с чужеродным агентом.

 

Антисыворотка: сыворотка крови, содержащая антитела против определенного антигена

 

Аутоиммунная болезнь: Болезнь, которая возникает в результате того, что иммунная система атакует клетки своего организма, считая их чужими. Примерами являются системная красная волчанка (эритематоз), ревматоидный артрит и множественный склероз.

 

Бактериофаг (фаг): вирус, который инфицирует бактерий. Может быть использован для того, чтобы внедрить чужеродную ДНК в бактериальный геном.

 

 

Вакцинация: процесс стимулирования образования вторичного иммунитета путем введения непатогенной формы агента, вызывающего болезнь. Слово «вакцинация» происходит от латинского слова vacca – корова- потому что первая проведенная вакцинация это была вакцинация коровьей оспой от оспы человеческой.

 

 

Врожденный иммунитет: иммунитет, с которым человек рождается. Включает в себя такие клетки, как циркулирующие макрофаги, которые первыми вступают в контакт с чужеродными агентами. Также называется неадаптивным иммунитетом.

 

 

Зооноз: инфекция, передаваемая людям от животных, например бешенство, или атипичная пневмония.

 

 

Клон, клонирование: в контексте молекулярной биологии, клонирование – это получение фрагмента ДНК из генома и сшивание его с другой молекулой ДНК, так что теперь эта другая молекула ДНК включает в себя полную копию клонированного фрагмента. В контексте клеточной биологии, «клон» - это группа клеток, произошедшая из одной родительской клетки и несущая идентичную генетическую информацию.

 

Коньюгат: вещество, образовавшееся в результате ковалентной сшивки двух разных молекул, например, фермента пероксидазы пришитой к антителу.

 

 

Генетически модифицированный организм (ГМО): организм, генетический материал которого был направленно изменен с помощью технологии рекомбинантной ДНК.

 

Иммунная недостаточность: ослабление иммунного ответа, так что иммунная система становится неспособной эффективно защищать организм от болезней. Может быть вызвана генетическими нарушениями, приемом иммуносупрессантов и другими факторами.

 

Иммуноген: любой агент, вызывающий иммунный ответ. Иммуногены. которые специфично узнаются Б и Т клетками и вызывают специфичный иммунный ответ (приобретенный иммунитет) называются антигенами.

 

Иммуноглобулин (Ig): общий термин для обозначения антител

 

Иммунология: изучение иммунной системы, системы органов, защищающей организм от чужеродных веществ, клеток и организмов.

 

Лигировать: соединить два фрагмента ДНК вместе, например, поместить фрагмент гена, кодирующего антитело, в геном фага.

 

Лимфоцит: вид белой кровяной клетки. Компонент иммунной системы. Б-лимфоциты созревают в костном мозге, а Т-лимфоциты в тимусе.

 

 

Макрофаг: вид белых кровяных клеток. Макрофаги могут окружать и поглощать чужеродные вещества и антигены, этот процесс называется фагоцитозом. У макрофагов есть две основных функции: 1) удаление чужеродных клеток и молекул из крови; 2) переработка (процессинг) антигенов и экспонировании их на своей поверхности.

 

Микроплашка: пластиковая 96-луночная плашка, предназначенная для ИФА

 

Оппортунистические инфекции: инфекции, возникающие при ослабленном иммунитете, например кандидоз и туберкулез, развивающиеся у больных СПИДом.

 

Пассивный иммунитет: приобретение антител из внешнего источника, например, передача с молоком матери или введение антител для лечения болезни (например, при заражении бешенством). Пассивный иммунитет длится только в течение нескольких недель.

 

 

Патоген: организм, или вещество, вызывающее болезнь. Патогенами могут быть бактерии, вирусы, грибы, паразитические одноклеточные, черви, и даже инфекционные белки (прионы).

 

Первичное антитело: в иммунологическом тесте, антитело,связывающее антиген и дающее специфичность тесту.

Вторичное антитело: в иммунологическом тесте, антитело,связывающее первичное антитело. Часто вторичные антитела помечены определенным образом для того, чтобы можно было их обнаружить.

 

Пероксидаза хрена: фермент, часто использующийся для определения вторичных антител. Катализирует окисление разных субстратов перекисью водорода (H₂O₂). Если в результате реакции образуется окрашенный продукт, он может быть определен колориметрически.

 

 

Приобретенный иммунитет: специфический ответ на определенное чужеродное вещество, возникающий в результате нескольких контактов с ним.

 

Сероконверсия: появление детектируемого уровня антител против определенного агента в крови. Например, антитела к ВИЧ в крови можно обнаружить лишь через 6 недель после заражения.

 

Субстрат: молекула, на которую действует данный фермент

 

Сыворотка: прозрачная жидкость, получающаяся при удалении из крови крупных частиц, т.е. красных и белых кровяных клеток.

 

ТМБ: см. 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин

 

 

Фаговый дисплей: метод создания новых антител против определенных антигенов с помощью технологии рекомбинантной ДНК и бактериофагов.

 

Фермент: белок с каталитической активностью. Молекула, на которую действует фермент, называется субстратом. Ферменты классифицируют и называют по видам реакций, которые они катализируют.

 

Хромогенный: «дающий цвет». Хромогенными называют субстраты ферментативных реакций, которые в результате реакции дают окрашенные продукты. Например, 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ) при окислении пероксидазой хрена дает синий продукт.

 

 

Эпитоп: отдельный участок на поверхности антигена, с которым связывается антитело. Также называется «антигенной детерминантой».

 

 

Приложение В: Описания болезней

ВИЧ/СПИД

 

Подходящие протоколы: все

 

Название патогена	Вирус иммунодефицита человека, ВИЧ
Тип организма	Ретровирус
Инфекционный агент	Вирус
Метод распространения	Половые контакты Использование общих игл при употреблении наркотиков Использование нестерильных медицинских инструментов От матери детям во время беременности При переливании крови или пересадке донорских органов Не распространяется при обычных контактах
Инкубационный период	От 2 месяцев до более 10 лет
Симптомы	В первые 1-2 месяца после заражения – симптомы гриппа Во время асимптоматического периода (от 2 месяцев до >10 лет) иммунная система медленно разрушается, и симптомы могут включать в себя потерю веса, слабость, частые лихорадки, частые грибковые заболевания, сыпь на коже, ухудшение кратковременной памяти   Во время развития СПИДа, из-за заражения оппортунистическими инфекциями может наблюдаться кашель, затруднение дыхания, судороги, потеря координации, нарушение сознания, частый понос, лихорадка, потеря зрения, тошнота, сильные головные боли, сильная слабость и кома.
Инфекционность	От времени заражения
Диагностика	В первые 4-8 недель после заражения вирус можно обнаружить с помощью ИФА к белку p24 или с помощью вестерн-блота   После 4-8 недель с помощью ИФА можно обнаружить в крови антитела к ВИЧ
Лечение	Ингибиторы обратной транскриптазы, например АЗТ Ингибиторы протеазы Комплексное антиретровирусное лечение Лечение оппортунистических инфекций
Смертность	Широко варьирует в зависимости от географического положения больных
История	Первый известный случай в 1959 году. ВИЧ мог распространиться от животных к человеку. Болезнь была описана и названа синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) в 1982 году, вирус иммунодефицита человека был выделен в 1983.

 

Предполагаемые сценарии для класса:

 

Ролевая игра, в которой ученики выполняют роль ученых в клинической лаборатории местной больницы и делают тесты на ВИЧ. Существуют тесты ИФА на антиген к ВИЧ (капсидный белок p24) и на сывороточные антитела к ВИЧ.

 

 

Оспа

 

Подходящие протоколы: все

 

Название патогена	Вирус оспы, Variola major
Тип организма	ДНК-вирус из рода Orthopoxvirus
Инфекционный агент	Вирус (для заражения достаточно нескольких вирусных частиц)
Метод распространения	От человека к человеку воздушно-капельным путем Через инфицированную одежду, постель или вещи Вирус может оставаться живым до 24 часов при оптимальных условиях
Инкубационный период	12-14 дней
Симптомы	Высокая температура, недомогание, боли головы и тела, сыпь на коже, переходящая в гнойные пузырьки (оспины)
Инфекционность	Период максимальной инфекционности - начало появления сыпи, инфекционность сохраняется до полного исчезновения сыпи.
Диагностика	По симптомам. Идентификация вируса с помощью электронной микроскопии. Идентификация вирусной ДНК молекулярно-биологическими методами. Разработка ИФА к IgG, IgM и антителам - важная задача для многих компаний (оспа была уничтожена до того, как появились современные иммунологические методы диагностики)
Лечение	Вакцинация в течение 2-3 дней после заражения предотвращает развитие заболевания Вакцинация в течение 4-5 дней после заражения может предупредить смертельный исход болезни После 4-5 дней, только поддерживающее лечение. Экспериментальное антивирусное лечение
Смертность	До 30%
История	Использовался в качестве биологического оружия Великобританией в Северной Америке в 18 веке. Армия раздавала индейцам одеяла, снятые с оспенных больных. Смертность в некоторых племенах индейцев достигала 50%. В 1796 году Дженнер создал на основе коровьей оспы вакцину, защищающую людей от оспы. Усилия по всеобщей вакцинации позволили искоренить оспу в 1977 году, и вакцинации были прекращены.

 

Предполагаемые сценарии для класса:

 

Протоколы I и II:

 

Ролевая игра: ваши ученики подверглись биологической атаке с использованием распыленного вируса оспы, возможно, кто-то заразился, в этом случае, ему необходима немедленная вакцинация. Вакцинировать всех подряд не очень хорошо, потому что вакцинация может иметь неприятные побочные эффекты Важно как можно быстрее узнать, кто заражен.

 

Протокол III:

 

Ролевая игра: ваши ученики исследуют, насколько долго сохраняются в крови антитела к оспе, полученные после вакцинации. Прививки были обязательны до 1978 года; надо определить, сохраняют ли современные 30-летние люди иммунитет к оспе.

 

Трихинеллез

 

Подходящие протоколы: протокол III

 

Название патогена	Trichinella spiralis и еще 4 родственных вида
Тип организма	Нематода
Инфекционный агент	Личинка
Метод распространения	Поедание цист личинок, содержащихся непрожаренном мясе (обычно свинине)
Инкубационный период	Личинки попадают в тонкий кишечник, где меньше чем за 8 дней достигают зрелости и размножаются. В течение следующих 1-4 месяцев они продуцируют до 1500 новых личинок. Эти личинки мигрируют в поперечно-полосатую мускулатуру, где формируют цисты (покоящиеся стадии). Цисты сохраняют жизнеспособность в течение многих лет.
Симптомы	Ранние симптомы (во время созревания личинок) могут включать тошноту, судороги и понос. В легких случаях симптомов может быть мало. Поздние симптомы включают температуру и боли в суставах и мышцах В особо тяжелых случаях инфекция может вызывать проблемы с координацией, сердцем и дыханием. Смерть возникает от воспаления сердечной ткани. Симптомы прекращаются только когда все личинки полностью сформируют цисты.
Инфекционность	Цисты могут содержаться в кале; тем не менее, заражение происходит только при поедании зараженного мяса.
Диагностика	Биопсия мышц (часто языка) ИФА для обнаружения антител против Trichinella
Лечение	Лечение нужно начать как можно раньше. Лечат только симптомы; аспирин и другие болеутоляющие используются для облегчения болей в мышцах, в случае особо сильных болей применяются стероидные препараты. Нет средства от образовавших цисты личинок Экспериментальное лечение мебендазолом, противогельминтным препаратом. Мебендазол не дает червю всасывать сахар и червь постепенно погибает от голода.
Смертность	Приблизительно 1%
История	Встречается повсеместно, но наиболее часто в Европе и Соединенных Штатах В течение 2,5 летнего периода в 1990 годах было зарегистрировано более 10 000 случаев во всем мире. Заражение происходило от мяса свиней, диких кабанов, лошадей и дичи.
Предотвращение	Личинки погибают при тщательной термической обработке мяса или при замораживании мяса Копчение мяса не всегда убивает личинок

 

Предполагаемые сценарии для класса:

 

Через месяц после поездки на шашлыки, некоторые из ваших учеников жалуются на тошноту и судороги. Вы подозреваете трихинеллез. ИФА на антитела против Trichinella подтверждает диагноз у некоторых учеников. (Антитела появляются в крови через 3-5 недель после заражения).

 

Атипичная пневмония

 

Подходящие протоколы: все

 

Название патогена	Коронавирус
Тип организма	Вирус
Инфекционный агент	Вирус
Метод распространения	Близкий контакт между людьми: кашель или чихание, заражение также может происходить когда люди дотрагиваются до зараженных поверхностей, а потом касаются руками глаз, рта или носа. Нет свидетельств того, что вирус распространяется по воздуху
Инкубационный период	Симптомы появляются в течение 10 дней после заражения
Симптомы	Температура выше 38ºС и другие симптомы, аналогичные гриппу. Респираторные симптомы (кашель и затруднение дыхания) могут наблюдаться после 2-7 дней инфекции
Инфекционность	Пациенты наиболее заразны примерно на 10 дне инфекции, когда у них выражены респираторные синдромы (кашель и чихание)
Диагностика	Первоначальный диагноз по симптомам и эпидемиологии: т.е. входил ли пациент в контакт с другим больным или был ли он в течение 10 дней в области, где наблюдается атипичная пневмония. Лабораторные тесты включают в себя: 1)ИФА для обнаружения вируса 2)ПЦР 3)Обнаружение РНК вируса с помощью обратной транскрипции 4) ИФА на антитела к вирусу (антитела могут быть обнаружены в крови в течение 21 дня после начала заболевания)
Лечение	Специальных лекарств нет. Симптомы лечатся стандартными лекарствами от симптомов пневмонии. Идут тесты антивирусных препаратов.
Смертность	По данным на май 2003, 8%
История	Впервые был выявлен в феврале 2003 года. Судя по всему, впервые появился в сельской местности Китая, возможно осенью 2002. Вирус распространяется по миру вместе с авиаперевозками

 

Предполагаемые сценарии для класса:

 

Некоторые из ваших учеников были в поездке в другой стране. Оказалось, что в отеле, в котором они жили, было зарегистрировано несколько случаев атипичной пневмонии. Надо сделать тесты, чтобы узнать, не заразился ли кто-то из них, и в последнем случае как можно быстрее изолировать больных.

 

Приложение Г: Дополнения к урокам

 

Справки по разным болезням

 

В Интернете, например, на сайте ВОЗ, можно найти много информации по разным инфекционным болезням. Также вы можете найти сайты фармацевтических компаний, предлагающих новейшие средства диагностики болезней. Вы можете попросить ваших учеников самостоятельно заполнить следующую таблицу для какой-то болезни, либо по выбору учеников, либо по вашему выбору.

Это задание поможет вашим ученикам научиться отличать «плохую» и «хорошую» информацию в Интернете. Есть множество сайтов, рекламирующих недоказанные средства лечения и содержащих неправильную медицинскую информацию, так как не существует служб, контролирующих распространение фальшивой информации в сети.

 

 

Название болезни:____________________

 

Название патогена
Тип организма
Инфекционный агент
Метод распространения
Инкубационный период
Симптомы
Инфекционность
Диагностика
Лечение
Смертность
История

 

Использованная литература:_________________________

 

 

 

 

 

Полуколичественный ИФА

 

ИФА не только быстро дает качественный (да/нет) ответ: основная его сила в возможности получать количественные (сколько?) результаты. Это дополнение описывает, как можно адаптировать этот набор, чтобы сделать количественный тест для определения концентрации антигена или антитела (в данном случае полуколичественный, потому что у вас скорее всего не будет требуемого специального оборудования). Приведенный ниже протокол написан для определения концентрации антигена (на базе протокола II), но он может быть адаптирован и к протоколу III.

 

Вы должны будете приготовить серийные разведения антигена в известной концентрации. По мере того, как концентрация антигена или антитела увеличивается, увеличивается интенсивность синей окраски. Интенсивность окраски можно зрительно сравнить с контрольными образцами известной концентрации и таким образом примерно оценить концентрацию антигена или антитела в образце. Для того,чтобы провести точные измерения, нужен специальный спектрофотометр для плашек. Спектрофотометр измеряет поглощение света определенной длины волны (например, окисленный субстрат ТМБ поглощает свет длиной 655 нм). Измерив поглощение опытного образца и контролей, можно достаточно точно установить концентрацию вещества в образце.

 

Подготовка преподавателя к работе

 

Мы настоятельно рекомендуем, чтобы вы хорошо освоились сначала с базовыми протоколами этого набора. Очень важно иметь в виду информацию про стабильность реагентов на стр. 19.

Подготовка к работе аналогична подготовке для протокола II, но на каждом рабочем месте будут две дополнительные пробирки: одна с образцом известной концентрации, другая с PBS. На одно рабочее место, рассчитанное на четырех человек, будут приходиться всего два опытных образца. Они будут содержать разный уровень антигена. Вы можете пометить их «А» и «Б» или инициалами воображаемых пациентов. Вам также понадобятся две чистые 15 мл пробирки или аналогичные емкости.

 

Полуколичественный ИФА: пошаговое руководство для подготовки

 

Рассчитано на подготовку 12 рабочих мест, каждое для 4 учеников

 

Реагенты в составе набора	Необходимое количество
Антиген, куриный гамма-глобулин, сухой	1 флакон
Первичные антитела, кроличьи анти-куриные поликлональные антитела, сухие	1 флакон
Вторичные антитела, козлиные анти-кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой, сухие	1 флакон
Субстрат пероксидазы (ТМБ)	1 банка
10х фосфатно-солевой буфер (PBS)	1 банка
10% Твин 20	1 банка
Дополнительные реагенты
Дистиллированная вода (рекомендуется стерильная вода)	1 л