Результаты по прослеживанию распространения болезни

Фамилия	+/-	Результат партнеров (+/-)

Фамилия	+/-	Результат партнеров (+/-)

 

 

Вопросы к лабораторной работе

 

1. Образцы, которые вы добавляете в лунки плашки, содержат множество разных белков, а также могут содержать или не содержать антиген. Что случится с белками в составе образца в лунке в случае, если образец содержит антиген? Если не содержит?

 

1. Почему необходимо на каждом этапе промывать лунки?

 

 

1. Что происходит, когда вы добавляете первичные антитела к образцам, содержащим антиген? Не содержащим антиген?

 

1. Что происходит, когда вы добавляете вторичные антитела к образцам, содержащим антиген? Не содержащим антиген?

 

1. Если ИФА дал отрицательный результат по агенту, вызывающему болезнь, означает ли это, что у вас нет данной болезни? По каким причинам результат может быть отрицательным в случае если вы на самом деле больны?

 

1. Почему вы проводите анализ ваших образцов в трех повторностях?

 

1. Какие основанные на антителах тесты вы можете купить в аптеке?

 

1. Если вы получили положительный результат теста в вашей работе, скажите, обменивались ли вы образцами с учениками, исходно получившими «зараженные» пробирки? Если нет, какие выводы вы можете сделать о распространении болезней в популяции?

 

 

Протокол II: ИФА для обнаружения антигена

Руководство преподавателя

Эта работа представляет из себя тест на наличие антигена в образце. Вы можете обсудить со своими учениками, как ИФА используется для того, чтобы обнаружить болезнетворные бактерии или вирусы в биологических образцах, например, в крови еще до того, как болезнь начала развиваться. Например, если вовремя (в течение 2-3 дней после инфекции) ввести вакцину человеку, зараженному вирусом оспы, он не заболеет. Вы также можете обсудить не связанные с болезнями применения ИФА, такие как тест на беременность с помощью определения ХГЧ, тесты на допинг, а также тестирование пищи для выявления белков из генномодифицированных организмов.

Тест-полоски на беременность и наркотики, которые вы можете купить в аптеке, также основаны на очень сходных с ИФА принципах.

Для того, чтобы лучше представлять себе контекст работы, ознакомьтесь с приложениями А, Б и В.

План уроков

 

Урок 1	Подготовка к работе	Лекция и обсуждение
Урок 2	Лабораторная работа по ИФА

 

 

Общий план работы

 

Шаг 1: с помощью микропипетки 50 мкл из образца каждого ученика, вместе с положительным и отрицательным контролями, добавляется в лунки плашки и инкубируется 5 минут, чтобы дать возможность белкам в составе образца связаться со стенками лунки. Затем лунки промываются промывочным буфером (PBST: фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.05% Твин 20) который кроме того блокирует оставшиеся свободными возможные места связывания для белков в лунке.

 

Шаг 2: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора первичных антител и инкубируется 5 мин при комнатной температуре. Первичные антитела узнают антигены и связываются с ними. Затем лунки опять промываются промывочным буфером, чтобы удалить несвязавшиеся антитела.

 

Шаг 3: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой и инкубируется 5 мин. Вторичные антитела узнают первичные антитела и связываются с ними. Пероксидаза это фермент, который окисляет хромогенный субстрат, что изменению его цвета. Лунки промываются PBST чтобы удалить несвязавшиеся вторичные антитела.

 

Шаг 4: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора субстрата (ТМБ) и ученики наблюдают за развитием окраски. Если в образце присутствовал антиген, то в данной лунке также будет присутствовать пероксидаза, и в течение 5 минут раствор в лунке посинеет. Если антигена в образце не было, раствор останется бесцветным.

 

 

Типичные результаты ИФА

 

Подготовка преподавателя к лабораторной работе

 

Этот раздел предназначен для того, чтобы вы хорошо подготовились к предстоящей работе. Мы рекомендуем вам прочитать все руководство (Протокол II) перед тем, как приступать к работе. Используйте информацию из приложения В, если вы хотите использовать сценарий урока, связанный с конкретной болезнью.

Самым важным для успеха работы будет, чтобы ученики капали в лунки нужные растворы в нужном порядке, поэтому подписывайте пробирки четко и понятно. Используйте пробирки разных цветов, как указано ниже.

 

Задачи

 

Шаг 1 Приготовить буферные растворы

Шаг 2 Приготовить 50x стоковые растворы антитела, первичных и вторичных антител

Шаг 3 Развести стоковые растворы

Шаг 4 Приготовить порции (аликвоты) растворов для рабочих мест учеников

Шаг 5 Подготовить рабочие места

 

Необходимое время

1-3 часа

 

Мы рекомендуем разводить сухой антиген и первичные антитела не раньше чем за 3 дня до начала работы, а вторичные антитела – в течение 24 часов перед началом работы. Также мы рекомендуем использовать стерильную дистиллированную воду для приготовления однократного PBS, чтобы избежать заражения реагентов. Растворы антител и антигена должны храниться на льду или на +4°С в холодильнике, если они приготовлены более чем за 4 часа до начала работы.

 

Внимание: если вы планируете использовать набор для проведения нескольких занятий в течение 1-2 недель, мы настоятельно рекомендуем использовать стерильную воду для приготовления PBS! Воду можно стерилизовать в 5-минутным кипячением в микроволновой печи в неплотно закрытой бутылке; когда вы вынете бутылку из микроволновки, дайте ей остыть, потом закрутите крышку. Разводите концентрированные растворы антигена и антител строго в том количестве, какое вам потребуется для урока. Оставшиеся стоковые растворы храните в холодильнике на 4°С, их можно использовать в течение двух недель. Не замораживайте растворы.

 

Измерение объема

Этот набор содержит одноразовые пластиковые пипетки для измерения объемов от 250 мкл до мл. Соответствующие отметки на пипетке показаны на рисунке. Чтобы добавить несколько миллилитров, просто добавьте нужное число раз по миллилитру. Вам также понадобятся микропипетки для добавления объема в 50 мкл. Для каждого шага подготовки к работе, используйте новую одноразовую пипетку или чистый носик для микропипетки.

Для измерения объема пенящихся жидкостей, содержащих детергент, отмеривайте объем по границе жидкости и пузырей.

 

 

Протокол II: пошаговое руководство для подготовки

 

Рассчитано на подготовку 12 рабочих мест, каждое для 4 учеников

 

Реагенты в составе набора	Необходимое количество
Антиген, куриный гамма-глобулин, сухой	1 флакон
Первичные антитела, кроличьи анти-куриные поликлональные антитела, сухие	1 флакон
Вторичные антитела, козлиные анти-кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой, сухие	1 флакон
Субстрат пероксидазы (ТМБ)	1 банка
10х фосфатно-солевой буфер (PBS)	1 банка
10% Твин 20	1 банка
Дополнительные реагенты
Дистиллированная вода (рекомендуется стерильная вода)	1 л