Лабораторный протокол в картинках

Список для проверки рабочих мест. Одно рабочее место рассчитано на 4 учеников

 

Предмет	Содержимое	Количество	(ü)
Желтые пробирки	Образцы для анализа (0.25 мл)	4 шт (по 1 на ученика)	q
Фиолетовая пробирка (+)	Положительный контроль (0.5 мл)	1 шт	q
Синяя пробирка (-)	Отрицательный контроль (0.5 мл)	1 шт	q
Зеленая пробирка (П.А.)	Первичные антитела (1.5 мл)	1 шт	q
Оранжевая пробирка (В.А.)	Вторичные антитела (1.5.мл)	1 шт	q
Коричневая пробирка (Субстрат)	Субстрат пероксидазы (ТМБ) 1.5 мл	1 шт	q
12-луночные стрипы		2 шт	q
Микропипетка		1 шт	q
Желтые носики для микропипетки		10-20 шт	q
Одноразовые пластиковые пипетки		1 шт	q
70-80 мл промывочного буфера в стакане	Фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0.05% Твин 20	1 шт	q
Большая пачка бумажных полотенец		2	q
Черный фломастер (маркер)		1 шт	q

 

 

1. Подпишите желтую микроцентрифужную пробирку вашими инициалами (именем).

 

1. Возьмите ваш 12-луночный стрип. Подпишите первые три лунки «+» (это будет положительный контроль), следующие три лунки «-» (отрицательный контроль). Следующие шесть лунок предназначаются для вашего опыта и опыта вашего напарника по работе (по три)
2. Чистым носиком перенесите по 50 мкл положительного контроля в первые три («+») лунки.

 

1. Чистым носиком перенесите по 50 мкл отрицательного контроля в следующие три («-») лунки.

 

 

1. Вместе с вашим напарником перенесите по 50 мкл ваших образцов в подписанные вашими именами лунки. Обязательно используйте чистый носик для каждого образца!

 

1. Подождите 5 минут, для того чтобы все белки в составе образца связались с плашкой.

 

 

1. ПРОМЫВКА:

 

А. Переверните стрип, положите его на пачку бумажных полотенец и легонько постучите по дну. Убедитесь, что брызги не попали обратно в лунки.

 

Б. Выкиньте верхнее полотенце.

 

В. Чистой пипеткой заполните каждую лунку буфером для промывки, стараясь не переливать его через стенки. Для всех стадий промывки можно использовать одну и ту же одноразовую пипетку.

 

Г. Опять положите стрип на пачку полотенец и постучите по дну.

 

Д. Выкиньте 2-3 верхних полотенца (которые промокли).

 

 

1. Повторите промывку (шаг 9) еще раз.

 

1.   Чистым носиком добавьте по 50 мкл раствора первичных антител во все 12 лунок.

 

 

1. Подождите 5 минут, чтобы антитела могли связаться с антигеном

 

1. Промойте лунки, повторив процедуру промывки (шаг 9) ДВА раза.

 

1. Чистым носиком добавьте по 50 мкл раствора вторичных антител во все 12 лунок.

 

1. Подождите 5 минут, чтобы вторичные антитела могли связаться с первичными.

 

 

1. Промойте лунки, повторив процедуру промывки (шаг 9) ТРИ раза.

 

1. Чистым носиком добавьте по 50 мкл субстрата пероксидазы во все 12 лунок.

 

 

1. Подождите 5 минут. Наблюдайте за тем, что получилось, и запишите ваши результаты.

 

 

 

Руководство для учеников

Введение

Когда вы заболеваете, ваш организм вырабатывает иммунный ответ. Молекулы, в ответ на которые вырабатывается иммунный ответ, это чужеродные молекулы, не встречающиеся в норме в вашем организме. Это могут быть части бактерий, вирусов или грибов. Через несколько дней в вашей крови уже циркулируют миллионы антител – белков, которые распознают антигены и прочно связываются с ними. Антитела нейтрализуют токсины и, с помощью других клеток или молекул иммунной системы, уничтожают чужеродные объекты.

Около 100 лет назад биологи обнаружили, что иммунная система животных реагирует на появление «чужеродных объектов», или антигенов. Сейчас антитела являются незаменимым средством, используемым в научных исследованиях, биотехнологии и для диагностики и лечения заболеваний. Число видов различных антител, циркулирующих в крови, по разным оценкам составляет от ¹⁰⁶ до 10¹¹; это означает, что существует антитело практически на любой возможный антиген. Антитела составляют до 15% общего белка вашей сыворотки крови. Антитела необычайно специфичны: каждое из них узнает только свой антиген.

А) Структура иммуноглобулина (антитела) IgG, связанного со своим антигеном – капсидным белком ВИЧ p24, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа (Harris et al., 1998, Momany et al., 1996). Эти структуры можно найти в базе данных PDB (Protein Data Bank, www.pdb.ufmg.br (Berman et al., 2000)) по кодам 1IGY и 1AFV и просмотреть на компьютере с помощью бесплатных программ, таких как JMol, Rasmol, Protein Explorer. Б) Распространенное схематичное изображение антитела, связанного с антигеном.

 

 

Как делаются антитела?

Ученые научились использовать иммунный ответ животных для того, чтобы производить антитела для диагностики и лечения болезней, а также для научных целей. Наука, изучающая иммунную систему, называется «иммунология». Животным, таким как куры, кролики, козы, овцы, лошади и др. можно ввести антиген (это называется «иммунизацией») и через какое-то время сыворотка «иммунизированных» животных будет содержать антитела к этому антигену. Если антиген имел отношение к агенту, вызывающему болезнь, полученные антитела можно использовать для диагностических тестов на данную болезнь. Антитела, узнающие антиген, в иммунологических тестах называются «первичными» антителами, они придают специфичность тесту. Другие виды антител, в том числе вторичные антитела, делаются таким же образом. Вторичные антитела узнают и связывают первичные антитела, которые являются антителами другого вида животных. Для того, чтобы их получить, животных иммунизируют антителами, полученными из другого вида животных. Они узнаются иммунной системой как чужеродные белки, и на них вырабатываются антитела. Например, для того,чтобы получить вторичные антитела, узнающие первичные человеческие антитела, человеческие антитела можно ввести в животное, например, в кролика. После того, как у кролика выработается иммунный ответ, его сыворотка будет содержать антитела, которые будут узнавать человеческие антитела и связываться с ними. Вторичные антитела, используемые в данной работе, конъюгированы (ковалентно связаны) с ферментом пероксидазой хрена. Пероксидаза катализирует окисление субстрата, ТМБ, перекисью водорода, в результате чего образуется окрашенный в синий продукт.