Содержал ли ваш образец антиген?

1. Образцы, которые вы добавляете в лунки плашки, содержат множество разных белков, а также могут содержать или не содержать антиген. Что случится с белками в составе образца в лунке в случае, если образец содержит антиген? Если не содержит?

 

1. Почему необходимо на каждом этапе промывать лунки?

 

 

1. Что происходит, когда вы добавляете первичные антитела к образцам, содержащим антиген? Не содержащим антиген?

 

1. Что происходит, когда вы добавляете вторичные антитела к образцам, содержащим антиген? Не содержащим антиген?

 

1. Если ИФА дал отрицательный результат по агенту, вызывающему болезнь, означает ли это, что у вас нет данной болезни? По каким причинам результат может быть отрицательным в случае если вы на самом деле больны?

 

1. Почему вы проводите анализ ваших образцов в трех повторностях?

 

1. Какие основанные на антителах тесты вы можете купить в аптеке?

 

 

Протокол III: ИФА для обнаружения антител

Руководство преподавателя

Этот протокол симулирует диагностический тест на наличие определенных антител в сыворотке крови. Ученикам даются образцы (предполагается, что это образцы сыворотки крови) и они с помощью ИФА определяют присутствие в них антител (антител к каким-то возбудителям болезней, сигнализирующим о заражении этой болезнью). Вы можете придумать любую болезнь, которая будет интересна вам и ученикам (ВИЧ, атипичная пневмония, трихинеллез, туберкулез, клещевой энцефалит и др.). Такой метод диагностики используется, когда антиген по какой-то причине не детектируется с помощью ИФА, но организм уже начал вырабатывать антитела и их можно обнаружить. Например, до недавнего времени, ВИЧ можно было диагностировать только с помощью такого теста. Сейчас, благодаря большим усилиям и вложениям средств в исследования по ВИЧ, стало возможно непосредственно определять антиген ВИЧ в крови с помощью ИФА, что позволяет обнаружить вирус на более ранней стадии, быстрее начать лечение и продлить жизнь больным.

Чтобы лучше подготовиться к урокам и придумать интересный контекст для работы, прочитайте это руководство и приложения А, Б и В.

План уроков

 

Урок 1	Подготовка к работе	Лекция и обсуждение
Урок 2	Лабораторная работа по ИФА

 

Общий план работы

 

Шаг 1: с помощью микропипетки 50 мкл раствора очищенного антигена к исследуемым антителам, добавляется в лунки плашки и инкубируется 5 минут, чтобы дать возможность белкам в составе образца связаться со стенками лунки. Затем лунки промываются промывочным буфером (PBST: фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.05% Твин 20) который кроме того блокирует оставшиеся свободными возможные места связывания для белков в лунке.

 

Шаг 2: в лунки добавляется 50 мкл исследуемого «образца сыворотки» (раствора, которые может содержать первичные антитела), а также положительный и отрицательный контроли (растворы, заведомо содержащие и не содержащие первичные антитела) и инкубируется 5 мин при комнатной температуре. Первичные антитела узнают антигены и связываются с ними. Затем лунки опять промываются промывочным буфером, чтобы удалить несвязавшиеся антитела.

 

Шаг 3: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой и инкубируется 5 мин. Вторичные антитела узнают первичные антитела (например, человеческие антитела, если вы симулируете диагностику определенной болезни) и связываются с ними. Пероксидаза это фермент, который окисляет хромогенный субстрат, что изменению его цвета. Лунки промываются PBST чтобы удалить несвязавшиеся вторичные антитела.

 

Шаг 4: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора субстрата (ТМБ) и ученики наблюдают за развитием окраски. Если в образце присутствовали первичные антитела к антигену («положительный дианоз»), то в данной лунке также будет присутствовать пероксидаза, и в течение 5 минут раствор в лунке посинеет. Если антител в образце не было, раствор останется бесцветным.

 

Типичные результаты ИФА

 

Подготовка преподавателя к лабораторной работе

 

Этот раздел предназначен для того, чтобы вы хорошо подготовились к предстоящей работе. Мы рекомендуем вам прочитать все руководство (Протокол III) перед тем, как приступать к работе. Используйте информацию из приложения В, если вы хотите использовать сценарий урока, связанный с конкретной болезнью.

Самым важным для успеха работы будет, чтобы ученики капали в лунки нужные растворы в нужном порядке, поэтому подписывайте пробирки четко и понятно. Используйте пробирки разных цветов, как указано ниже.

 

Задачи

 

Шаг 1 Приготовить буферные растворы

Шаг 2 Приготовить 50x стоковые растворы антитела, первичных и вторичных антител

Шаг 3 Развести стоковые растворы

Шаг 4 Приготовить порции (аликвоты) растворов для рабочих мест учеников

Шаг 5 Подготовить рабочие места

 

Необходимое время

1-3 часа

 

Мы рекомендуем разводить сухой антиген и первичные антитела не раньше чем за 3 дня до начала работы, а вторичные антитела – в течение 24 часов перед началом работы. Также мы рекомендуем использовать стерильную дистиллированную воду для приготовления однократного PBS, чтобы избежать заражения реагентов. Растворы антител и антигена должны храниться на льду или на +4°С в холодильнике, если они приготовлены более чем за 4 часа до начала работы.

 

Внимание: если вы планируете использовать набор для проведения нескольких занятий в течение 1-2 недель, мы настоятельно рекомендуем использовать стерильную воду для приготовления PBS! Воду можно стерилизовать в 5-минутным кипячением в микроволновой печи в неплотно закрытой бутылке; когда вы вынете бутылку из микроволновки, дайте ей остыть, потом закрутите крышку. Разводите концентрированные растворы антигена и антител строго в том количестве, какое вам потребуется для урока. Оставшиеся стоковые растворы храните в холодильнике на 4°С, их можно использовать в течение двух недель. Не замораживайте растворы.

 

Измерение объема

Этот набор содержит одноразовые пластиковые пипетки для измерения объемов от 250 мкл до мл. Соответствующие отметки на пипетке показаны на рисунке. Чтобы добавить несколько миллилитров, просто добавьте нужное число раз по миллилитру. Вам также понадобятся микропипетки для добавления объема в 50 мкл. Для каждого шага подготовки к работе, используйте новую одноразовую пипетку или чистый носик для микропипетки.

Для измерения объема пенящихся жидкостей, содержащих детергент, отмеривайте объем по границе жидкости и пузырей.

 

 

Протокол III: пошаговое руководство для подготовки

 

Рассчитано на подготовку 12 рабочих мест, каждое для 4 учеников

 

Реагенты в составе набора	Необходимое количество
Антиген, куриный гамма-глобулин, сухой	1 флакон
Первичные антитела, кроличьи анти-куриные поликлональные антитела, сухие	1 флакон
Вторичные антитела, козлиные анти-кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой, сухие	1 флакон
Субстрат пероксидазы (ТМБ)	1 банка
10х фосфатно-солевой буфер (PBS)	1 банка
10% Твин 20	1 банка
Дополнительные реагенты
Дистиллированная вода (рекомендуется стерильная вода)	1 л