Диагностика инфекционных заболеваний

 

Инфекционные заболевания диагностируются по наблюдаемым симптомам и с помощью лабораторных тестов. Тесты могут быть основаны на поиске самого микроорганизма или его частей (бактериальных и вирусных антигенов), продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (например, бактериальных токсинов) или на реакции организма на возбудителя болезни (присутствие антител или измененные концентрации каких-либо белков). В последнее десятилетие обычными стали тесты на наличие вирусной или бактериальной ДНК или РНК.

 

Лабораторные тесты включают в себя множество методов, некоторые из которых использовались на протяжении десятилетий, а некоторые, как тесты на ДНК и РНК с помощью ПЦР сравнительно новые. В зависимости от типа теста и предполагаемого диагноза, можно проверить наличие инфекции в слюне, крови, моче, кале и спинномозговой жидкости.

 

Первые тесты для обнаружения и определения микроорганизмов в клинических образцах были основаны на антисыворотке к определенным микробам. Антитела несли на себе флуоресцентную метку, и если они связывались с микробами, их можно было увидеть под микроскопом. Другие ранние тесты включали: 1) выращивание культуры микроорганизмов из образца на разных питательных средах, наблюдение за их внешним видом и определение – такой тест часто занимает недели; 2)определение специфических антител в крови с помощью разновидностей иммуноферментного анализа и 3) тесты по иммунопреципитации в агаре, когда антиген и антисыворотка диффундируют в агаре и формируют видимые полосы когда связываются друг с другом. Многие из этих тестов по-прежнему применяются.

 

Применяемые в настоящий момент диагностические тесты включают:

 

Тип теста	Описание	Примеры
Иммунофлуоресцентный анализ	Детекция определенных микроорганизмов с помощью флуоресцентных меток	E. coli O157:H7 Идентификация респираторных вирусов
Агглютинация	Образование видимого осадка при связывании антигена и антитела	Грам-положительные бактерии, такие как Staphylococcus aureus Грибы (Cryptococcus neoformans и Candida sp.)
Иммунохроматография	Тесты на бумажных полосках или карточках	E. coli O157:H7 Legionella Mycoplasma pneumoniae
Тесты на плашках	ИФА или РИА (радиоимммунологический анализ) для определения микроорганизмов, продуктов их жизнедеятельности, и антител. В РИА вместе ферментов используется радиоактивная метка.	E. coli O157:H7 Legionella Вирус гриппа Антиген ВИЧ Антитела к ВИЧ Giardia
Молекулярные методы	Обнаружение микробной РНК или ДНК с помощью ПЦР и других методов; используется также для выявления бактериальной устойчивости к антибиотикам	Mycobacterium tuberculosis ВИЧ Chlamydia trachomatis Цитомегаловирус (CMV) Тестирование на устойчивость к антибиотикам
Микроскопия	Визуальная идентификация, основанная на специфическом окрашивании или физических характеристиках.	Электронная микроскопия вируса Эболы Световая микроскопия паразитов (простейших, гельминтов и.т.п.)

 

Стимулирование иммунной системы с помощью вакцинации:

 

Доктора используют свойства иммунного ответа для того, чтобы придать нам устойчивость к определенным заболеваниям до того, как мы с ними столкнемся. Во время вакцинации наш организм сталкивается с безвредными формами патогена, которые вызывают первичный иммунный ответ. Также необходимы частые бустер-дозы вакцины, чтобы вызывать вторичный иммунный ответ и поддерживать в крови высокий уровень антител. Для иммунизации используются разные виды вакцин:

 

1) Живые аттенюированные вакцины состоят из ослабленных (аттенюированных) микробов, не способных вызвать болезнь. С помощью современных методов, можно ослабить микробы удалив или инактивировав некоторые гены; раньше ученые просто отбирали менее патогенные штаммы, возникающие естественным путем. Примеры живых вакцин: вакцина от полиомиелита (вакцина Сабина), от кори, свинки и оспы.

2) Убитые, или инактивированные вакцины сделаны из микробов, убитых при нагревании или химическом воздействии. Инактивированные вакцины гораздо безопаснее, чем живые, особенно для людей с ослабленным иммунитетом, но они обычно не вызывают такого сильного иммунного ответа, как живые вакцины. Примерами таких вакцин могут служить вакцины от бешенства, холеры, полиомиелита (вакцина Солка) и гриппа.

3) Субъединичные вакцины состоят из частей микробов. Они включают в себя один или несколько антигенов и могут быть произведены из организмов или получены с помощью молекулярно-биологических методов. Примерами могут служить вакцины от гепатита Б, сибирской язвы или столбняка.

4) ДНК-вакцины - это новое слово в разработке вакцин. ДНК, кодирующая микробные антигены, вводится пациенту. Она попадает в клетки, транскрибируется и транслируется, и синтезируемый белок вызывает иммунный ответ. Пока еще ни одна ДНК-вакцина не используется, но некоторые проходят клинические испытания.

5) Вакцины из антител – это еще одно новшевство. Способность производить человеческие моноклональные антитела с помощью технологии рекомбинантной ДНК означает, что можно приготовить антитела против какого-то микроорганизма и безопасно вводить их людям. Например, человеческие моноклональные антитела против одного из антигенов сибирской язвы скоро могут начать прохождение клинических испытаний.

6) Иммунотерапия – это вакцинация, используемая для лечения болезни уже после заражения. Некоторые варианты иммунотерапии применяются уже много лет, например введение сывороточных иммуноглобулинов при заражении гепатитом или введение лошадиного антивенина (сыворотки, содержащей антитела к различным ядам) при укусе змеи. Других примеров иммунотерапии не так много. Пожалуй, самым известным является вакцинация от бешенства, состоящая из 5 доз вакцины, вводимых в течение 30 дней. Если начать курс вакцинации сразу же после заражения, вакцина со 100% эффективностью предотвращает бешенство. Вакцинация от оспы также предотвращает развитие болезни, даже если вакцина введена в течение 2-3 дней после заражения. Если вакцина введена через 5 дней после заражения, она предотвращает возможный смертельный исход заболевания, хотя уже не предотвращает саму болезнь.

 

Получение антител

 

Используемые для исследований антитела могут быть получены в лаборатории, как in vivo, так и in vitro. Есть два типа получаемых антител: поликлональные и моноклональные (последние стали доступны только в течение последних 30 лет).

В настоящий момент технологии рекомбинантной ДНК коренным образом изменили методики получения антител, и хотя большинство антител еще производят традиционными методами используя животных или культуры клеток животных, методы с использованием рекомбинантной ДНК становятся все более и более распространенными.

Хронология технологии получения антител

 

Поликлональные антитела

 

Поликлональные антитела получают, иммунизируя животных (обычно кроликов, овец или коз) и собирая их сыворотку. Например, можно ввести в козу очищенный белок ВИЧ gp120 и в ее организме будут синтезироваться антитела ко многим эпитопам этого белка. Затем из козы берется кровь, содержащая антитела, и из крови удаляются клетки. То, что получилось, называется антисывороткой к gp120. Она может непосредственно использоваться для экспериментов, или из нее выделяется фракция иммуноглобулинов. Полученные антитела называются поликлональными, потому что они представляют собой смесь антител, произведенных многими разными клонами B клеток. Поликлональные антитела просто и дешево получить, но во-первых, они представляют из себя смесь антител ко всем возможным эпитопам, во-вторых, результаты выделения антител, даже из одного и того же животного, никогда не будут одинаковыми.

 

Моноклональные антитела

 

Для многих областей применения, например, для диагностических тестов, поликлональные антитела плохо подходят из-за высокой степени изменчивости. Во многих случаях предпочтительно иметь один вид антител из клона одинаковых B клеток. Клоны клеток, производящих только одно определенное антитело, можно получить из селезенки иммунизированной мыши, но такие клетки в лаборатории живут лишь несколько недель, что ограничивает возможности для масштабного получения антител. Тем не менее, B клетки могут приобрести возможность жить и производить антитела неограниченно долго, если слить их с бессмертными (раковыми) клетками. Полученная в результате такого слияния клеточная линия называется «гибридомой». Моноклональные антитела, производимые гибридными клетками, можно выделять из среды, в которой растут клетки; такие антитела всегда будут полностью идентичны друг другу.