Химическое и биологическое оружие и ИФА

 

В последнее время биологическое оружие стало часто обсуждаться в средствах массовой информации, поэтому мы включили небольшой раздел, посвященный биологическому оружию.

 

Человек использует биологическое оружие уже давным-давно. В 6 веке до нашей эры ассирийцы отравляли колодцы своих врагов спорыньей; аналогично афиняне отравляли вражеские источники воды растением, имеющим слабительное действие. В 18 веке вожди американских индейцев получали в подарок одеяла, снятые с оспенных больных, что вызывало массовые эпидемии. В более недавнее время болгарский диссидент-перебежчик Георгий Марков был убит в Лондоне с помощью рицина (токсина из касторовых бобов). Он был уколот в ногу с помощью острого наконечника зонтика, пока ждал автобуса на остановке. В 2001 году в США в новостные агентства и правительственные учреждения по почте рассылались споры сибирской язвы.

 

Во время любой биологической атаки, важнейшей задачей является скорейшее обнаружение и идентификация биологического агента и связанной с ним болезни. Необходимо распознать источник заболевания и определить, кто был инфицирован, чтобы предоставить им лечение и/или изолировать. Например, если инфекция оспой будет обнаружена в течение 2-3 дня после заражения, и будет введена вакцина, заболевание не разовьется. Вакцинация в течение 4-5 дней после заражения может предотвратить фатальный исход. Тем не менее, вакцинация против оспы сама по себе сопряжена с риском, поэтому встает вопрос о том, нужно ли иммунизировать не зараженных людей.

 

Американский центр по контролю и предотвращению болезней разделяет возбудителей заболеваний и токсины, которые могут быть применены в качестве оружия, на три группы по степени опасности, в основном исходя из легкости распространения.

 

К первой группе относятся легко распространяющиеся болезни с высокой степенью смертности, способные вызвать панику среди людей. Примерами являются сибирская язва (Bacillus anthracis), ботулизм (Clostridium botulinum toxin), чума (Yersinia pestis), оспа (Variola major), туляремия (Francisella tularensis) и вирусные геморрагические лихорадки (вызванные филовирусами, например Эбола и Марбург и аренавирусами, например Ласса и Мачупо)

 

Ко второй группе относятся заболевания, которые легче лечатся и не настолько смертоносны, такие как бруцеллез (Brucella sp), отравления токсином эпсилон Clostridia perfringens, пищевые отравления (Salmonella sp, Escherichia coli O157:H7, Shigella sp), сап (Burkholderia mallei), мелиоидоз (Burkholderia pseudomallei), орнитоз (Chlamydia psittaci), ку-лихорадка (Coxiella burnetii), отравление рицином из касторовых бобов (Ricinus communis), отравление стафилококковым энтеротоксином Б, сыпной тиф (Rickettsia prowazekii), вирусные энцефалиты, вызванные альфавирусами (например, венесуэльский лошадиный энцефалит, восточный лошадиный энцефалит и западный лошадиный энцефалит) и патогены, распространяющиеся в воде (Vibrio cholerae, вызывающий холеру и Cryptosporidium parvum, вызывающий криптоспоридиоз)

 

К последней категории относятся патогены, которые могут стать угрозой в будущем, например вирус Нипах и хантавирусы (вирусы животных, передающиеся людям).

 

Диагностика и идентификация биологических агентов является важной частью ответа на биологическую атаку. Также важными являются планы по предотвращению таких атак и готовности к ним и здесь важной частью является образование.

 

 

Протокол I: ИФА для отслеживания распространения болезни

Руководство преподавателя

 

Этот протокол сопровождает ИФА игрой, в которой ученики должны обмениваться своими образцами, моделируя «распространение болезни». Каждому ученику дается образец, один или два из которых «заражены» (т.е. содержат антиген). После того как ученики совершат ряд обменов образцами («контактов») со своими товарищами, они тестируют их с помощью ИФА. Оказывается, что у большей части класса анализ положительный! Таким образом, ученики получают представление о том, как болезнь распространяется в популяции и оказываются заинтересованы этим вопросом. Этот протокол имитирует распространение таких болезней как атипичная пневмония, простуда, грипп, ВИЧ и заболеваний, передающихся половым путем. В приложении С приведены описания некоторых болезней и возможные «сценарии» для лабораторной работы. Разумеется, можно провести работу и не указывая конкретную «болезнь».

 

План уроков

 

Урок 1	Подготовка к работе	Лекция и обсуждение
Урок 2	Обмен образцами между учениками	Лабораторная работа по ИФА
Урок 3	Анализ результатов ИФА	Отслеживание распространения болезни

 

Общий план работы

 

Шаг 1: ученики «контактируют» друг с другом, смешивая свой образец с образцами других учеников. Двое учеников смешивают свои образцы и каждый забирает половину смешанного образца. Каждый ученик обменивается один или два раза (в зависимости от размера класса) и записывает имена тех, с кем обменялся.

 

 

Шаг 2: с помощью микропипетки 50 мкл из образца каждого ученика, вместе с положительным и отрицательным контролями, добавляется в лунки плашки и инкубируется 5 минут, чтобы дать возможность белкам в составе образца связаться со стенками лунки. Затем лунки промываются промывочным буфером (PBST: фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.05% Твин 20) который кроме того блокирует оставшиеся свободными возможные места связывания для белков в лунке.

 

Шаг 3: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора первичных антител и инкубируется 5 мин при комнатной температуре. Первичные антитела узнают антигены («возбудителей болезни») и связываются с ними. Затем лунки опять промываются промывочным буфером, чтобы удалить несвязавшиеся антитела.

 

Шаг 4: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой и инкубируется 5 мин. Вторичные антитела узнают первичные антитела и связываются с ними. Пероксидаза это фермент, который окисляет хромогенный субстрат, что изменению его цвета. Лунки промываются PBST чтобы удалить несвязавшиеся вторичные антитела.

 

Шаг 5: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора субстрата (ТМБ) и ученики наблюдают за развитием окраски. Если в образце присутствовал антиген, то в данной лунке также будет присутствовать пероксидаза, и в течение 5 минут раствор в лунке посинеет. Если антигена в образце не было, раствор останется бесцветным.

 

Типичные результаты ИФА