Колориметрическое определение: окисление ТМБ пероксидазой

Контроли: контроли всегда делаются одновременно с опытными образцами, чтобы удостовериться, что процедура работает нормально. Контроли могут помочь разобраться с неоднозначными результаты, возникающими из-за человеческой ошибки или загрязненных реагентов. Контроли должны быть включены в любые тесты ИФА, чтобы их результаты могли считаться действительными. Для проведения отрицательного контроля, нужно убрать из образца антиген или первичное антитело (как в данной работе), или заменить антиген на другое вещество, которое не связывается специфично с антителами. Положительный контроль всегда содержит предполагаемый антиген и первичные антитела. Отрицательный образец, в котором тест дает положительный результат, называется ложноположительным. Положительный образец, в котором тест дал отрицательные результаты, называется ложноотрицательным. Многие тесты, применяемые в диагностике, дают определенный процент ложноположительных или ложноотрицательных результатов, поэтому важно подтверждение диагноза в другом независимом тесте. Например, тесты на наличие антител к ВИЧ могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Ложноположительные могут возникать от проведенных вакцинаций, а ложноотрицательные – от подавления иммунной системы (например, при приеме лекарств, применяемых при трансплантации) или когда тест сделан слишком рано и инфекция еще не успела развиться (Антитела против ВИЧ появляются в крови через несколько недель после заражения; появление специфических антител называется сероконверсией). Поэтому положительный тест на ВИЧ всегда дополнительно подтверждается вестерн-блотом (см. стр. 105)

В ИФА, аналогичных протоколам I и II (когда экспериментальным параметром является наличие антигена), отрицательным контролем будут являться лунки, не содержащие антигена. Любая окраска, которая разовьется в этих лунках, будет являться следствием: а) неспецифического связывания антител; б) экпериментальной ошибки. Подходящим положительным контролем будет являться образец, заведомо содержащий антиген. В тестах ИФА аналогичных протоколу III (в которых экспериментальным параметрам является наличие первичных антител) отрицательным контролем будут являться лунки, не содержащие первичных антител. Любая окраска, развивающаяся в этих лунках, будет следствием неспецифического связывания вторичных антител, или экспериментальной ошибки. Положительным контролем будет являться образец с добавленными первичными антителами. Специальные контрольные растворы входят в состав многих коммерчески доступных наборов для ИФА, применяемых в клинике.

Анализ результатов: ИФА может дать как качественный (да или нет) так и количественный (сколько) результат. Качественный ответ можно получить на глаз, без помощи специального оборудования. Количественные результаты тоже можно оценить на глаз и отмечать, например (++) – сильный сигнал, (+) – слабый сигнал, (+/-) – сомнительный сигнал, (-) – отсутствие сигнала. Для точного определения концентраций необходим ридер (спектрофотометр) для плашек. Этот прибор измеряет поглощение света с определенной длиной волны в каждой лунке плашки относительно поглощения в контрольных лунках. Пик поглощения синей формы TMБ – 655 нм. Контроли для количественного анализа ИФА включают набор растворов известной концентрации для построения стандартной кривой. Стандартная кривая позволяет количественно определить концентрации антигена в образце, что в свою очередь, помогает исследователю или врачу определить степень развития какого-то инфекционного заболевания. Описание того, как выполнить количественный тест ИФА (без использования спектрофотометра) приведено в приложении Г.

ИФА так часто выполняется в медицинских и научных лабораториях, что существует множество коммерчески доступных наборов для определения разных антигенов. Такие наборы включают все компоненты и контроли, необходимые для проведения теста. Доступны тесты для диагностики аутоиммунных заболеваний, вирусов, бактерий, токсинов, генетических нарушений и.т.п.

Данный учебный набор демонстрирует один из возможных конкретных методов выполнения ИФА. Он относится к группе методов с захватом антитела - когда антиген иммобилизуется на дне лунки, и антитело связывается (оказывается захваченным) антигеном. Вторичные антитела связаны с ферментом пероксидазой хрена, который способен окислять хромогенный субстрат (ТМБ), что приводит к появлению синей окраски.

В тестах, основанных на захвате антигена, на дне лунки иммобилизуются первичные антитела, к которым затем добавляется антиген. В свою очередь, антиген узнается вторичными антителами, так же конъюгированными с пероксидазой, что приводит к развитию синей окраски при добавлении ТМБ.

Применения ИФА

ИФА является не только важнейшим диагностическим средством в медицине, но и применяется во многих других областях, в том числе в ветеринарии, тестировании пищи и сельском хозяйстве. Вот некоторые примеры: