Исследование под руководством учителя

Набор для иммуноферментного анализа (ИФА)

Учебное руководство

Иммунология это наука, изучающая иммунную систему, то есть то как наш организм защищает себя от чужеродных и потенциально болезнетворных микроорганизмов и молекул. У иммунной системы есть три основных функции:

 

1. Распознавать чужеродные молекулы (захватчиков)

2. Адекватно реагировать на них, чтобы защитить организм

3. Отреагировать в следующий раз при встрече с теми же патогенами

 

 

Иммунная система млекопитающих производит молекулы, называемые антителами, которые способны распознавать чужеродные молекулы с невероятной точностью. Антитела находят свои цели и связываются с ними, как самонаводящиеся ракеты. Присоединяясь к чужеродным молекулам и клеткам, антитела делают их узнаваемыми для клеток иммунной системы, с помощью которых они могут быть уничтожены. Антитела стали важнейшей частью современных медицинских и биотехнологий, они используются в научных исследованиях, лечении и диагностике болезней.

 

Эта лабораторная работа облегчает изучение функций иммунной системы и знакомит вас с уникальными свойствами антител, благодаря которым они нашли столь широкое применение в медицине и биотехнологии.

 

Что такое ИФА?

 

ИФА расшифровывается как и ммуно ф ерментный а нализ. Это удобный тест, основанный на антителах, который используется для диагностики таких заболеваний как атипичная пневмония и ВИЧ, и для того, чтобы отслеживать

распространение патогенных микроорганизмов в пище, воде и воздухе. ИФА также применяется для того, чтобы идентифицировать продукты, изготовленные с использованием генетически модифицированных организмов, аллергены в пище, и молекулярные маркеры беременности и применения наркотиков.

 

Этот набор позволяет подойти к ИФА с трех разных сторон (см. следующую страницу). Для каждого подхода даны свои учебные материалы, руководства для учителей и учеников. Преподаватели или ученики должны выбрать наиболее подходящий протокол для лабораторной работы.

 

Исследование под руководством учителя

 

Задача этих учебных материалов – провести ваших учеников через процесс, имитирующий любое научное лабораторное исследование. У учеников, выполнивших эту работу, развивается уверенность в их способности применять реальные средства научных исследований к важным задачам. Вопросы, приведенные в руководствах для учеников, направлены на то, чтобы максимизировать их вовлеченность в работу. В результате ученики понимают ценность организованного и логически правильного подхода к решению научных задач.

 

Мы приветствуем ваши идеи и дополнения!

 

 

Содержание

 

 

Контрольный список(ü) содержания набора.. 5

Как работает этот набор.. 6

Введение в ИФА.. 9

Химическое и биологическое оружие и ИФА.. 15

Протокол I: ИФА для отслеживания распространения болезни.. 17

Руководство преподавателя.. 17

Общий план работы.. 18

Подготовка преподавателя к лабораторной работе. 19

Ответы на вопросы и темы для обсуждения для учителей. 25

Лабораторный протокол в картинках. 29

Руководство для учеников.. 33

Введение. 33

Лабораторный протокол. 37

Протокол II: ИФА для обнаружения антигена.. 45

Руководство преподавателя.. 45

Общий план работы.. 46

Подготовка преподавателя к лабораторной работе. 47

Ответы на вопросы и темы для обсуждения для учителей. 52

Лабораторный протокол в картинках. 55

Руководство для учеников.. 58

Введение. 58

Лабораторный протокол. 63

Протокол III: ИФА для обнаружения антител.. 69

Руководство преподавателя.. 69

Общий план работы.. 70

Подготовка преподавателя к лабораторной работе. 71

Ответы на вопросы и темы для обсуждения для учителей. 75

Лабораторный протокол в картинках. 79

Руководство для учеников.. 82

Введение. 82

Лабораторный протокол. 88

Приложение А: Иммунологические концепции.. 95

Приложение Б: Словарь терминов.. 108

Приложение Г: Дополнения к урокам.. 119

Полуколичественный ИФА.. 120

Приложение Д: Библиография.. 127

Полезные Интернет-ресурсы: 127

 

 

 

Контрольный список(ü) содержания набора

 

В этом разделе перечислены все компоненты, входящие в состав набора по ИФА и требуемые дополнительные принадлежности. Каждый набор рассчитан на 12 рабочих мест для учеников (максимально до 4 учеников на одно рабочее место). Проверьте с помощью этого списка, все ли у вас есть, перед тем как начать работу.

 

 

Компоненты в составе набора	Число/на один набор	(ü)
Антиген, куриный гамма-глобулин	1 флакон	q
Первичные антитела, кроличьи поликлональные анти-куриные антитела, лиофилизованные	1 флакон	q
Вторичные антитела, козьи анти-кроличьи, коньюгированные с пероксидазой хрена, лиофилизованные	1 флакон	q
Субстрат пероксидазы, 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ)	1 банка	q
10 х фосфатно - солевой буфер (phosphate-buffered saline, PBS)	1 банка	q
10% Твин 20 (Tween 20)	1 банка	q
Одноразовые пластиковые пипетки	80	q
Микроплашки со стрипами по 12 лунок	3 плашки с 8 стрипами по 12 лунок	q
Желтые микроцентрифужные пробирки, 2 мл	1 упаковка	q
Цветные микроцентрифужные пробирки, 2 мл (по 15 зеленого, голубого, оранжевого, фиолетового и коричневого цветов)	1 упаковка	q
Необходимые дополнительные принадлежности	Число/на класс	(ü)
Микропипетки на 50 мкл	12	q
Наконечники (носики) для пипеток	150	q
Бумажные полотенца	4 рулона	q
Стаканы на 100-200 мл	12	q
50 мл банки или пробирки для реагентов	3	q
Фломастеры (черные)	12	q
Мерный цилиндр, 100 мл	1	q
Мерный цилиндр, 1 литр	1	q
Дистиллированная вода	1 литр	q
Штативы для микропробирок	12	q

 

Как работает этот набор

 

 

С помощью этого набора вы сможете выполнить три различных протокола ИФА: протестировать образец на присутствие антигена (протоколы I и II) или на присутствие антител (протокол III). Положительным контролем на то, что тест работает правильно, является, соответственно антиген или антитело.

 

Протокол ИФА	Реальное применение	Положительный контроль
Протокол I ИФА для отслеживания распространения болезни Шаг 1: обмен образцами («контакт») между учениками Шаг 2: протокол ИФА для обнаружения антигена Шаг 3: прослеживание распространения «болезни»	Изучение распространения ВИЧ, атипичной пневмонии, простудных заболеваний, оспы, сибирской язвы, гриппа, венерических заболеваний	Антиген
Протокол II ИФА для обнаружения антигена ИФА для обнаружения специфических антигенов в образце	Тесты на беременность, наркотики, наличие аллергенов и продуктов ГМО в пище Тестирование воздуха, воды и пищи Тесты на ВИЧ, оспу, атипичную пневмонию и др.	Антиген
Протокол III ИФА для обнаружения антител Диагностика заболевания по наличию специфических антител в «образце крови» с помощью ИФА	Диагностика ВИЧ, трихинеллеза, атипичной пневмонии и др. по наличию специфических антител в крови	Антитело

 

Как выбрать протокол?

 

Мы предоставляем отдельное руководство для каждого протокола, с отдельными блоками для преподавателей и учеников. Учителя или ученики могут сами выбрать наиболее подходящую работу. Три протокола отражают растущую глубину погружения в предмет, от общего знакомства с иммунологией в протоколе I, до подробного изучения механизмов иммунитета в протоколе III. Из-за того, что мы хотели предоставить отдельные руководства для каждого протокола, некоторая информация в них повторяется.

Все три протокола это вариации на одну и ту же тему, но каждый подход показывает ИФА в разном контексте. Чтобы лучше подобрать контекст, ознакомьтесь с введением (ниже) и приложениями А и Б. Приложение В содержит полезную информацию про разные болезни и возможные сценарии для урока.

После того, как вы выберите протокол, прочитайте введение и дальше читайте руководство для вашего протокола.

 

Вопросы безопасности

 

В помещении, где проводится работа, нельзя есть, пить, курить и пользоваться косметикой. Рекомендуется использование защитных очков и перчаток. Ученики должны вымыть руки с мылом до и после работы. Если какой-то из растворов попадет в глаза, промойте их водой в течение 15 минут.

 

Хранение

 

Откройте набор сразу после получения и храните компоненты на +4°С или при комнатной температуре согласно указаниям.

Пошаговое описание ИФА

Шаг 1: антиген добавляется в лунки плашки и инкубируется для того, чтобы связаться со стенками. Несвязавшийся антиген отмывается от лунок детергентом. Детергент также используется как блокирующий агент, занимая все возможные места для посадки белка на лунках и тем самым предотвращая неспецифическое связывание антитела.

 

Шаг 2: раствор первичных антител добавляется в лунки и инкубируется, для того, чтобы антитела связались с антигеном. Несвязавшиеся антитела отмываются от лунок

 

Шаг 3: добавляется раствор конъюгированных с ферментом вторичных антител и инкубируется, для того, чтобы вторичные антитела связались с первичными. Затем несвязавшиеся вторичные антитела отмываются от лунок.

 

Шаг 4: добавляется хромогенный субстрат фермента и инкубируется для развития окраски. Оцениваются результаты анализа. В лунках, оставшихся бесцветными анализ отрицательный, в лунках, ставших синими – положительный.

 

 

Введение в ИФА

 

 

Следующий раздел кратко описывает технические и теоретические моменты, непосредственно связанные с данной лабораторной работой. Понимание учениками этих моментов чрезвычайно важно для успеха работы.

 

Плашки для ИФА: плашки сделаны из полистирола, который связывает (адсорбирует) белки из-за гидрофобных взаимодействий. В этом наборе используются 96-луночные плашки, разделенные на 8 снимаемых рядов (стрипов) по 12 лунок. Ученики используют один стрип на двоих. Вместимость каждой лунки около 250 мкл (μl).

Антиген: в этом наборе в качестве антигена используется куриный гамма-глобулин (выделенный из яичных желтков), который в этой работе играет роль любого гипотетического антигена.

 

Время инкубации: скорость связывания определяется температурой инкубации и концентрациями реагентов. Этот набор оптимизирован так, что каждую инкубацию можно провести за 5 минут при комнатной температуре. Увеличение продолжительности инкубации или температуры приведет к усилению окраски и в частности может привести к возникновению фоновой окраски в контрольных лунках.

 

Забивка: вещества для забивки добавляются после связывания антигена, чтобы воспрепятствовать неспецифическому связыванию антител с пластиком, что приведет к возникновению ложноположительных результатов. Для забивки может использоваться белок или детергент (или оба вместе). Обычно для этих целей применяют Твин 20 (неионный детергент, используемый в этом наборе), обезжиренное сухое молоко, желатин и бычий сывороточный альбумин (БСА). Хотя в этом протоколе вполне достаточно использовать только Твин 20, вы можете в учебных целях добавить дополнительную стадию забивки: пусть ваши ученики после добавления антигена добавят 50 мкл 1%-го раствора желатина в промывочном буфере и инкубируют 15 минут, потом промоют лунки.

 

Первичные антитела: первичными антителами называются антитела, которые узнают и связывают антиген. В этом наборе в качестве первичных используются поликлональные кроличьи антитела против гамма-глобулина. В протоколе III эти антитела выступают в качестве «человеческих антител в образце сыворотки крови».

 

Вторичные антитела: вторичные антитела узнают и связывают первичные антитела. Они выделяются из животных другого вида, чем те, из которых были получены первичные антитела. При создании этого набора, козы были иммунизированы кроличьим иммуноглобулином IgG для того, чтобы получить из их крови вторичные антитела.

Колориметрическое определение: вторичные антитела для ИФА конъюгированы с ферментом, так, что обнаружение вторичных антител, связавшихся с первичными, происходит за счет ферментативной реакции. В этом наборе вторичные антитела конъюгированы с пероксидазой хрена. В присутствии перекиси водорода (H₂O₂) пероксидаза катализирует окисление хромогенного субстрата 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) с образованием синего продукта реакции. Внимание: ТМБ светочувствителен и результаты теста должны определяться через 5-10 минут после добавления субстрата. Если инкубировать стрипы дольше, может развиться неспецифическая окраска – ее не надо учитывать в результатах теста. Через 20-30 минут цвет может поблекнуть из-за того, что ТМБ будет выпадать в осадок.

 

 

 

Применения ИФА

 

ИФА является не только важнейшим диагностическим средством в медицине, но и применяется во многих других областях, в том числе в ветеринарии, тестировании пищи и сельском хозяйстве. Вот некоторые примеры:

 

 

Область	Способ применения
Медицина и ветеринария	Диагностика заболеваний человека, таких как ВИЧ, атипичная пневмония, трихинеллез, туберкулез и др. по наличию антител в крови Диагностика вирусов, таких как вирус лейкемии кошек и вирус кошачьего иммунодефицита у кошек Обнаружение паразитов, таких как кардионематоды у собак Диагностика проблем с щитовидной железой у собак и кошек с помощью измерения концентрации тироксина (t4) в крови Диагностика лошадиного энцефалита у с помощью определения арбовирусов в крови.
Сельское хозяйство	Обнаружение вирусов растений, таких как вирус скручивания листьев картофеля или вирус мозаики огурцов Обнаружение микотоксинов в зерне, например афлатоксинов в зерне и кукурузе. Обнаружение вирусов в декоративных растениях, например желтой мозаики фасоли у гладиолусов Отслеживание подмены не-ГМО злаков генно-модифицированными растениями
Охрана окружающей среды	Тестирование качества воздуха в помещениях, например, обнаружение плесневых токсинов
Качество и безопасность пищевых продуктов	Предотвращение распространения коровьего бешенства с помощью контроля состава мяса. Определение подлинности происхождения продуктов (т.е.определение белков коровьего молока в козьем молоке или белков из не-твердых сортов пшеницы в продуктах из твердых сортов) Предотвращение аллергических реакций с помощью обнаружения не указанных производителем ингредиентов, например следов арахиса в продуктах
Другое	Определение применения запрещенных лекарств и препаратов (допинга, кокаина, марихуаны, амфетаминов) Подтверждение беременности с помощью определения человеческого хорионного гонадотропина (ХГЧ) в моче

 

Руководство преподавателя

 

Этот протокол сопровождает ИФА игрой, в которой ученики должны обмениваться своими образцами, моделируя «распространение болезни». Каждому ученику дается образец, один или два из которых «заражены» (т.е. содержат антиген). После того как ученики совершат ряд обменов образцами («контактов») со своими товарищами, они тестируют их с помощью ИФА. Оказывается, что у большей части класса анализ положительный! Таким образом, ученики получают представление о том, как болезнь распространяется в популяции и оказываются заинтересованы этим вопросом. Этот протокол имитирует распространение таких болезней как атипичная пневмония, простуда, грипп, ВИЧ и заболеваний, передающихся половым путем. В приложении С приведены описания некоторых болезней и возможные «сценарии» для лабораторной работы. Разумеется, можно провести работу и не указывая конкретную «болезнь».

 

План уроков

 

Урок 1	Подготовка к работе	Лекция и обсуждение
Урок 2	Обмен образцами между учениками	Лабораторная работа по ИФА
Урок 3	Анализ результатов ИФА	Отслеживание распространения болезни

 

Общий план работы

 

Шаг 1: ученики «контактируют» друг с другом, смешивая свой образец с образцами других учеников. Двое учеников смешивают свои образцы и каждый забирает половину смешанного образца. Каждый ученик обменивается один или два раза (в зависимости от размера класса) и записывает имена тех, с кем обменялся.

 

 

Шаг 2: с помощью микропипетки 50 мкл из образца каждого ученика, вместе с положительным и отрицательным контролями, добавляется в лунки плашки и инкубируется 5 минут, чтобы дать возможность белкам в составе образца связаться со стенками лунки. Затем лунки промываются промывочным буфером (PBST: фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.05% Твин 20) который кроме того блокирует оставшиеся свободными возможные места связывания для белков в лунке.

 

Шаг 3: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора первичных антител и инкубируется 5 мин при комнатной температуре. Первичные антитела узнают антигены («возбудителей болезни») и связываются с ними. Затем лунки опять промываются промывочным буфером, чтобы удалить несвязавшиеся антитела.

 

Шаг 4: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой и инкубируется 5 мин. Вторичные антитела узнают первичные антитела и связываются с ними. Пероксидаза это фермент, который окисляет хромогенный субстрат, что изменению его цвета. Лунки промываются PBST чтобы удалить несвязавшиеся вторичные антитела.

 

Шаг 5: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора субстрата (ТМБ) и ученики наблюдают за развитием окраски. Если в образце присутствовал антиген, то в данной лунке также будет присутствовать пероксидаза, и в течение 5 минут раствор в лунке посинеет. Если антигена в образце не было, раствор останется бесцветным.

 

Типичные результаты ИФА

 

Подготовка преподавателя к лабораторной работе

 

Этот раздел предназначен для того, чтобы вы хорошо подготовились к предстоящей работе. Мы рекомендуем вам прочитать все руководство (Протокол I) перед тем, как приступать к работе. Используйте информацию из приложения В, если вы хотите использовать сценарий урока, связанный с конкретной болезнью.

Самым важным для успеха работы будет, чтобы ученики капали в лунки нужные растворы в нужном порядке, поэтому подписывайте пробирки четко и понятно. Используйте пробирки разных цветов, как указано ниже.

 

Задачи

 

Шаг 1 Приготовить буферные растворы

Шаг 2 Приготовить 50x стоковые растворы антитела, первичных и вторичных антител

Шаг 3 Развести стоковые растворы

Шаг 4 Приготовить порции (аликвоты) растворов для рабочих мест учеников

Шаг 5 Подготовить рабочие места

 

Необходимое время

1-3 часа

 

Мы рекомендуем разводить сухой антиген и первичные антитела не раньше чем за 3 дня до начала работы, а вторичные антитела – в течение 24 часов перед началом работы. Также мы рекомендуем использовать стерильную дистиллированную воду для приготовления однократного PBS, чтобы избежать заражения реагентов. Растворы антител и антигена должны храниться на льду или на +4°С в холодильнике, если они приготовлены более чем за 4 часа до начала работы.

 

Внимание: если вы планируете использовать набор для проведения нескольких занятий в течение 1-2 недель, мы настоятельно рекомендуем использовать стерильную воду для приготовления PBS! Воду можно стерилизовать в 5-минутным кипячением в микроволновой печи в неплотно закрытой бутылке; когда вы вынете бутылку из микроволновки, дайте ей остыть, потом закрутите крышку. Разводите  концентрированные растворы антигена и антител строго в том количестве, какое вам потребуется для урока. Оставшиеся стоковые растворы храните в холодильнике на 4°С, их можно использовать в течение двух недель. Не замораживайте растворы.

 

Измерение объема

 

Этот набор содержит одноразовые пластиковые пипетки для измерения объемов от 250 мкл до мл. Соответствующие отметки на пипетке показаны на рисунке. Чтобы добавить несколько миллилитров, просто добавьте нужное число раз по миллилитру. Вам также понадобятся микропипетки для добавления объема в 50 мкл. Для каждого шага подготовки к работе, используйте новую одноразовую пипетку или чистый носик для микропипетки.

Для измерения объема пенящихся жидкостей, содержащих детергент, отмеривайте объем по границе жидкости и пузырей.

 

Протокол I: пошаговое руководство для подготовки

 

Рассчитано на подготовку 12 рабочих мест, каждое для 4 учеников

 

Реагенты в составе набора	Необходимое количество
Антиген, куриный гамма-глобулин, сухой	1 флакон
Первичные антитела, кроличьи анти-куриные поликлональные антитела, сухие	1 флакон
Вторичные антитела, козьи анти-кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой, сухие	1 флакон
Субстрат пероксидазы (ТМБ)	1 банка
10х фосфатно-солевой буфер (PBS)	1 банка
10% Твин 20	1 банка
Дополнительные реагенты
Дистиллированная вода (рекомендуется стерильная вода)	1 л

 

 

Руководство для учеников

Введение

Вы будете выполнять эксперимент, в котором вы обменяетесь образцами (совершите «контакт») с вашими одноклассниками. После обмена вы проведете и ммуно ф ерментный а нализ (ИФА), чтобы определить, «заразились» ли вы «болезнью». В ИФА с помощью антител обнаруживается присутствие агента, вызывающего болезнь (например, бактерий, вирусов или паразитов) в крови или другой жидкости из вашего тела (которая симулируется вашими образцами). Затем вы попробуете отследить распространение «болезни» в вашем классе до ее источника.

 

Когда вы заболеваете, ваш организм вырабатывает иммунный ответ. Молекулы, в ответ на которые вырабатывается иммунный ответ, это чужеродные молекулы, не встречающиеся в норме в вашем организме. Это могут быть части бактерий, вирусов или грибов. Через несколько дней в вашей крови уже циркулируют миллионы антител – белков, которые распознают антигены и прочно связываются с ними. Антитела нейтрализуют токсины и, с помощью других клеток или молекул иммунной системы, уничтожают чужеродные объекты.

Около 100 лет назад биологи обнаружили, что иммунная система животных реагирует на появление «чужеродных объектов», или антигенов. Сейчас антитела являются незаменимым средством, используемым в научных исследованиях, биотехнологии и для диагностики и лечения заболеваний. Число видов различных антител, циркулирующих в крови, по разным оценкам составляет от ¹⁰⁶ до 10¹¹; это означает, что существует антитело практически на любой возможный антиген. Антитела составляют до 15% общего белка вашей сыворотки крови. Антитела необычайно специфичны: каждое из них узнает только свой антиген.

А) Структура иммуноглобулина (антитела) IgG, связанного со своим антигеном – капсидным белком ВИЧ p24, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа (Harris et al., 1998, Momany et al., 1996). Эти структуры можно найти в базе данных PDB (Protein Data Bank, www.pdb.ufmg.br (Berman et al., 2000)) по кодам 1IGY и 1AFV и просмотреть на компьютере с помощью бесплатных программ, таких как JMol, Rasmol, Protein Explorer. Б) Распространенное схематичное изображение антитела, связанного с антигеном.

Как делаются антитела?

Ученые научились использовать иммунный ответ животных для того, чтобы производить антитела для диагностики и лечения болезней, а также для научных целей. Наука, изучающая иммунную систему, называется «иммунология». Животным, таким как куры, кролики, козы, овцы, лошади и др. можно ввести антиген (это называется «иммунизацией») и через какое-то время сыворотка «иммунизированных» животных будет содержать антитела к этому антигену. Если антиген имел отношение к агенту, вызывающему болезнь, полученные антитела можно использовать для диагностических тестов на данную болезнь. Антитела, узнающие антиген, в иммунологических тестах называются «первичными» антителами, они придают специфичность тесту. Другие виды антител, в том числе вторичные антитела, делаются таким же образом. Вторичные антитела узнают и связывают первичные антитела, которые являются антителами другого вида животных. Для того чтобы их получить, животных иммунизируют антителами, полученными из другого вида животных. Они узнаются иммунной системой как чужеродные белки, и на них вырабатываются антитела. Например, для того,чтобы получить вторичные антитела, узнающие первичные человеческие антитела, человеческие антитела можно ввести в животное, например, в кролика. После того, как у кролика выработается иммунный ответ, его сыворотка будет содержать антитела, которые будут узнавать человеческие антитела и связываться с ними. Вторичные антитела, используемые в данной работе, конъюгированы (ковалентно связаны) с ферментом пероксидазой хрена. Пероксидаза катализирует окисление субстрата, ТМБ, перекисью водорода, в результате чего образуется окрашенный в синий продукт.

 

 

Зачем нужны контроли?

 

Положительный и отрицательный контроли являются необходимой частью любого теста. Они позволяют нам убедиться в том, что тест работает корректно. Положительный контроль это образец, в котором заведомо содержится исследуемый антиген, а отрицательный контроль – заведомо чистый образец.

 

Ваша задача сегодня

 

Вам будут предоставлены средства и экспериментальный протокол для выполнения ИФА. Вам будет дан образец, которым вам надо будет обменяться со своими товарищами, имитируя контакт людей друг с другом и перенос инфекций. Один или два образца в классе будут исходно «инфицированными», т.е. будут содержать антиген. Вам также будут предоставлены контрольные образцы (положительный и отрицательный контроли). Вместе с другими учениками вы должны будете протестировать ваши образцы на содержание «болезнетворного агента» и проследить как «болезнь» распространяется по классу.

 

Давайте приступим к работе.

 

 

Ваша задача:

 

Шаг 1: обменяться образцами с другими учениками

 

Шаг 2: Добавить ваши образцы и контроли в лунки плашки.

Ваши образцы содержат много разных белков и могут содержать или не содержать антиген. Подождите 5 минут, чтобы дать возможность всем белкам за счет гидрофобных взаимодействий связаться со пластиком плашки.

 

 

Шаг 3: добавить в лунку антитела против антигена – первичные антитела. Если в вашем образце присутствовал антиген, первичные антитела найдут его молекулы среди всех других молекул, и прочно свяжутся с ними.

 

 

Шаг 4: добавить соединенные с ферментом – пероксидазой вторичные антитела (антитела на антитела). Если в образце есть первичные антитела, связанные с антигеном, вторичные антитела свяжутся с ними.

 

 

Шаг 5: добавить субстрат пероксидазы, подождать 5 минут, и оценить результаты анализа. Если раствор в лунке станет синим, анализ положительный (ваш образец «заражен»). Если раствор останется бесцветным, анализ отрицательный.

Вопросы до лабораторной работы

Как расшифровывается ИФА?

 

 

Лабораторный протокол

 

 

Обмен образцами

1. Подпишите желтую микроцентрифужную пробирку и одноразовую пластиковую пипетку вашими инициалами (именем).

 

1. С помощью пипетки перенесите весь ваш образец в пробирку другого ученика. Аккуратно перемешайте образцы, пипетируя раствор в пробирке, потом отберите половину обратно в свою пробирку. Запишите имя вашего первого партнера.

1. По просьбе учителя, повторите обмен еще два раза. Запишите имена ваших партнеров. После этого шага выкиньте пипетку.

 

Здесь работа может быть остановлена. В этом случае надо поместить образцы на +4°С

Выполнение ИФА

 

1. Возьмите ваш 12-луночный стрип. Подпишите первые три лунки «+» (это будет положительный контроль), следующие три лунки «-» (отрицательный контроль). Следующие шесть лунок предназначаются для вашего опыта и опыта вашего напарника по работе (по три), подпишите их вашими инициалами. Например, Митя Гиляров и Аня Лопатина подписали бы свои лунки так:

 

1. Для связывания антигена:

 

а. Чистым носиком перенесите по 50 мкл положительного контроля из фиолетовой пробирки в первые три («+») лунки.

 

б. Чистым носиком перенесите по 50 мкл отрицательного контроля из синей пробирки в следующие три («-») лунки.

 

в. Вместе с вашим напарником перенесите по 50 мкл ваших образцов в подписанные вашими именами лунки. Обязательно используйте чистый носик для каждого образца!

 

1. Подождите 5 минут, для того чтобы все белки в составе образца связались с плашкой.

 

1. Промойте лунки:

 

А. Переверните стрип, положите его на пачку бумажных полотенец и легонько постучите по дну. Убедитесь, что брызги не попали обратно в лунки.

 

 

Б. Выкиньте верхнее полотенце.

 

В. Чистой пипеткой заполните каждую лунку буфером для промывки из стакана, стараясь не переливать его через стенки. Для всех стадий промывки можно использовать одну и ту же одноразовую пипетку.

 

Г. Опять положите стрип на пачку полотенец и постучите по дну.

 

 

 

Д. Выкиньте 2-3 верхних полотенца (которые промокли).

 

 

1. Повторите всю процедуру промывки (шаг 7) еще раз.

 

 

1.   Чистым носиком добавьте по 50 мкл раствора первичных антител («П.А».)из зеленой микропробирки во все 12 лунок.

 

 

 

1. Подождите 5 минут, чтобы антитела могли связаться с антигеном

 

1. Промойте лунки, повторив процедуру промывки ДВА раза.

 

 

1. Чистым носиком добавьте по 50 мкл раствора вторичных антител («В.А.») из оранжевой пробирки во все 12 лунок.

 

1. Подождите 5 минут, чтобы вторичные антитела могли связаться с первичными.

 

 

1. Промойте лунки, повторив процедуру промывки ТРИ раза.

 

1. Чистым носиком добавьте по 50 мкл субстрата пероксидазы («Субстрат») из коричневой пробирки во все 12 лунок.

 

 

 

1. Подождите 5 минут. Наблюдайте за тем, что получилось, и запишите ваши результаты.

 

Результаты

 

Обозначьте лунки на картинке так же, как лунки в вашем эксперименте и напишите «+» на тех лунках, которые стали синими и «-» - на тех, которые остались бесцветными.

 

Заражены ли вы болезнью? (ДА/НЕТ) обведите

 

Вы можете проследить за распространением болезни, если каждый напишет результат своего теста напротив имен тех, с кем он обменивался (своих партнеров).

 

Руководство преподавателя

Эта работа представляет из себя тест на наличие антигена в образце. Вы можете обсудить со своими учениками, как ИФА используется для того, чтобы обнаружить болезнетворные бактерии или вирусы в биологических образцах, например, в крови еще до того, как болезнь начала развиваться. Например, если вовремя (в течение 2-3 дней после инфекции) ввести вакцину человеку, зараженному вирусом оспы, он не заболеет. Вы также можете обсудить не связанные с болезнями применения ИФА, такие как тест на беременность с помощью определения ХГЧ, тесты на допинг, а также тестирование пищи для выявления белков из генномодифицированных организмов.

Тест-полоски на беременность и наркотики, которые вы можете купить в аптеке, также основаны на очень сходных с ИФА принципах.

Для того, чтобы лучше представлять себе контекст работы, ознакомьтесь с приложениями А, Б и В.

План уроков

 

Урок 1	Подготовка к работе	Лекция и обсуждение
Урок 2	Лабораторная работа по ИФА

 

 

Общий план работы

 

Шаг 1: с помощью микропипетки 50 мкл из образца каждого ученика, вместе с положительным и отрицательным контролями, добавляется в лунки плашки и инкубируется 5 минут, чтобы дать возможность белкам в составе образца связаться со стенками лунки. Затем лунки промываются промывочным буфером (PBST: фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.05% Твин 20) который кроме того блокирует оставшиеся свободными возможные места связывания для белков в лунке.

 

Шаг 2: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора первичных антител и инкубируется 5 мин при комнатной температуре. Первичные антитела узнают антигены и связываются с ними. Затем лунки опять промываются промывочным буфером, чтобы удалить несвязавшиеся антитела.

 

Шаг 3: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой и инкубируется 5 мин. Вторичные антитела узнают первичные антитела и связываются с ними. Пероксидаза это фермент, который окисляет хромогенный