Протокол I : ИФА для отслеживания распространения болезни

 

Заинтересуйте ваших учеников, перед тем как провести ИФА для обнаружения антигена. Ученики должны отследить распространение воображаемой заразной «болезни» в их классе. Начиная с одного или двух случайно выбранных «зараженных», ученики обмениваются образцами («вступают в контакт»). Затем они проводят ИФА и отслеживают распространение «болезни» по классу. Эта игра предоставляет дополнительную возможность обсудить на уроке вопросы здравоохранения и эпидемиологии. Болезни, распространение которых в реальности можно контролировать с помощью подобных протоколов – это ВИЧ, атипичная пневмония, простуда, оспа, сибирская язва, грипп и заболевания, передающиеся половым путем. Как преподаватель, вы сами можете придумать наиболее подходящий для урока и учеников контекст этой задачи.

 

Протокол II: ИФА для обнаружения антигена

 

Тест на наличие антигена в «биологическом образце». Этот протокол можно использовать для обсуждения того, как с помощью ИФА можно детектировать болезнь еще до того, как организм выработал определяемый иммунный ответ. Одним из применений такого метода является обнаружение оспы. Если оспа детектирована вовремя и больному введена вакцина в течение 2-3 дней после заражения, то болезнь не развивается. С другой стороны, можно обсудить, как ИФА используется для определения беременности, загрязнения воды и воздуха, обнаружения аллергенов и ГМ-продуктов в пище.

 

Протокол III: ИФА для обнаружения антител

 

Тест на присутствие антител к определенным антигенам в воображаемом «образце крови пациента». Этот тип ИФА используется, когда антиген по каким-то причинам невозможно детектировать, или когда организм уже выработал иммунный ответ и в крови есть антитела. Классический пример анализа такого рода – анализ на ВИЧ. До недавнего времени, единственным способом диагностировать ВИЧ на ранней стадии было определение в крови антител к вирусу, а не определение самого вируса. Организм начинает производить антитела к вирусу в количестве, которое можно обнаружить с помощью ИФА, гораздо раньше, чем сам вирус размножится до обнаруживаемого уровня.

 

 

Как выбрать протокол?

 

Мы предоставляем отдельное руководство для каждого протокола, с отдельными блоками для преподавателей и учеников. Учителя или ученики могут сами выбрать наиболее подходящую работу. Три протокола отражают растущую глубину погружения в предмет, от общего знакомства с иммунологией в протоколе I, до подробного изучения механизмов иммунитета в протоколе III. Из-за того, что мы хотели предоставить отдельные руководства для каждого протокола, некоторая информация в них повторяется.

Все три протокола это вариации на одну и ту же тему, но каждый подход показывает ИФА в разном контексте. Чтобы лучше подобрать контекст, ознакомьтесь с введением (ниже) и приложениями А и Б. Приложение В содержит полезную информацию про разные болезни и возможные сценарии для урока.

После того, как вы выберите протокол, прочитайте введение и дальше читайте руководство для вашего протокола.

 

Вопросы безопасности

 

В помещении, где проводится работа, нельзя есть, пить, курить и пользоваться косметикой. Рекомендуется использование защитных очков и перчаток. Ученики должны вымыть руки с мылом до и после работы. Если какой-то из растворов попадет в глаза, промойте их водой в течение 15 минут.

 

Хранение

 

Откройте набор сразу после получения и храните компоненты на +4°С или при комнатной температуре согласно указаниям.

Пошаговое описание ИФА

Шаг 1: антиген добавляется в лунки плашки и инкубируется для того, чтобы связаться со стенками. Несвязавшийся антиген отмывается от лунок детергентом. Детергент также используется как блокирующий агент, занимая все возможные места для посадки белка на лунках и тем самым предотвращая неспецифическое связывание антитела.

 

Шаг 2: раствор первичных антител добавляется в лунки и инкубируется, для того, чтобы антитела связались с антигеном. Несвязавшиеся антитела отмываются от лунок

 

Шаг 3: добавляется раствор конъюгированных с ферментом вторичных антител и инкубируется, для того, чтобы вторичные антитела связались с первичными. Затем несвязавшиеся вторичные антитела отмываются от лунок.

 

Шаг 4: добавляется хромогенный субстрат фермента и инкубируется для развития окраски. Оцениваются результаты анализа. В лунках, оставшихся бесцветными анализ отрицательный, в лунках, ставших синими – положительный.

 

 

Введение в ИФА

 

 

Следующий раздел кратко описывает технические и теоретические моменты, непосредственно связанные с данной лабораторной работой. Понимание учениками этих моментов чрезвычайно важно для успеха работы.

 

Плашки для ИФА: плашки сделаны из полистирола, который связывает (адсорбирует) белки из-за гидрофобных взаимодействий. В этом наборе используются 96-луночные плашки, разделенные на 8 снимаемых рядов (стрипов) по 12 лунок. Ученики используют один стрип на двоих. Вместимость каждой лунки около 250 мкл (μl).

Антиген: в этом наборе в качестве антигена используется куриный гамма-глобулин (выделенный из яичных желтков), который в этой работе играет роль любого гипотетического антигена.

 

Время инкубации: скорость связывания определяется температурой инкубации и концентрациями реагентов. Этот набор оптимизирован так, что каждую инкубацию можно провести за 5 минут при комнатной температуре. Увеличение продолжительности инкубации или температуры приведет к усилению окраски и в частности может привести к возникновению фоновой окраски в контрольных лунках.

 

Забивка: вещества для забивки добавляются после связывания антигена, чтобы воспрепятствовать неспецифическому связыванию антител с пластиком, что приведет к возникновению ложноположительных результатов. Для забивки может использоваться белок или детергент (или оба вместе). Обычно для этих целей применяют Твин 20 (неионный детергент, используемый в этом наборе), обезжиренное сухое молоко, желатин и бычий сывороточный альбумин (БСА). Хотя в этом протоколе вполне достаточно использовать только Твин 20, вы можете в учебных целях добавить дополнительную стадию забивки: пусть ваши ученики после добавления антигена добавят 50 мкл 1%-го раствора желатина в промывочном буфере и инкубируют 15 минут, потом промоют лунки.

 

Первичные антитела: первичными антителами называются антитела, которые узнают и связывают антиген. В этом наборе в качестве первичных используются поликлональные кроличьи антитела против гамма-глобулина. В протоколе III эти антитела выступают в качестве «человеческих антител в образце сыворотки крови».

 

Вторичные антитела: вторичные антитела узнают и связывают первичные антитела. Они выделяются из животных другого вида, чем те, из которых были получены первичные антитела. При создании этого набора, козы были иммунизированы кроличьим иммуноглобулином IgG для того, чтобы получить из их крови вторичные антитела.

Колориметрическое определение: вторичные антитела для ИФА конъюгированы с ферментом, так, что обнаружение вторичных антител, связавшихся с первичными, происходит за счет ферментативной реакции. В этом наборе вторичные антитела конъюгированы с пероксидазой хрена. В присутствии перекиси водорода (H₂O₂) пероксидаза катализирует окисление хромогенного субстрата 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) с образованием синего продукта реакции. Внимание: ТМБ светочувствителен и результаты теста должны определяться через 5-10 минут после добавления субстрата. Если инкубировать стрипы дольше, может развиться неспецифическая окраска – ее не надо учитывать в результатах теста. Через 20-30 минут цвет может поблекнуть из-за того, что ТМБ будет выпадать в осадок.