Использование трансгенных мышей для получения человеческих монАТ.

В последние годы появились сообщения о создании линий мышей, способных продуцировать человеческие антитела.

6.1. Общие схемы получения мышей- продуцентов человеческих антител.

Перед создателями таких линий стояло две задачи: во-первых, инактивировать собственные мышиные Ig гены, а, во-вторых, вставить в мышиный геном клонированные гены человеческих иммуноглобулинов. Общий размер всех иммуноглобулиновых генов, которые предполагалось вставить, (тяжелые цепи, легкие цепи класса каппа и регуляторные элементы) превысил 1,5 миллиона пар оснований.

Клонирование таких больших фрагментов стало возможным с использованием технологии искусственной дрожжевой хромосомы, представляющей собой дрожжевую библиотеку человеческих иммуноглобулиновых генов размером в миллионы нуклеотидных пар. Такую дрожжевую хромосому вводили в эмбриональную стволовую клетку (ЭСК) мыши путем слияния сферопласта дрожжевой клетки и ЭСК.

В результате в составе этой дрожжевой хромосомы были введены иммуноглобулиновые гены, соответствующие интактной зародышевой клетке человека, а именно: 245 тыс. пар оснований (kb), кодирующие мю и дельта константные регионы тяжелых цепей, внутренний D-регион,интронный энхансер и пять V-генов от четырех VH семейств; 190kb- kde-элемент (kappa deleting element), энхансеры интрона и 3`-конца, константный регион легкой цепи класса каппа, все пять J-генов легкой цепи каппа и три V-гена легкой цепи каппа. При этом были получены мыши, имеющие в своем геноме все эти перечисленные человеческие иммуноглобулиновые гены. Затем следовало скрещивание этих мышей с линией мышей, дефицитных по продукции мышиных иммуноглобулинов.

Прекращение продукции мышиных иммуноглобулинов было достигнуто следующим путем: в ЭСК мыши направленно разрушали либоJH-регион тяжелой цепи Ig, необходимый для первого этапа генной перестройки, либо константный регион легкой цепи. Мыши с нарушениями в генах тяжелых цепей скрещивались с мышами с нарушенными генами легких цепей до появления особей, гомозиготных по обеим мутациям. Такие мыши не продуцировали иммуноглобулины, но были способны к генным перестройкам и к экспрессии человеческихиммуноглобулиновых генов.

Другим подходом, опробованным для получения человеческих антител в мышах, было использование человеческих Ig минигенов, которые были сконструированы соединением вместе геномных сегментов вариабельных и константных регионов человеческих Ig локусов.Трансгенные мыши, продуцирующие человеческие антитела, были получены путем микроинъекции в пронуклеус стволовой клетки конструкции, состоящей из сегментов тяжелых цепей (4 VH- сегмента, 15 D-сегментов, 6 J-сегментов, мю- и гамма 1- кодирующие экзоны и их соответствующие регионы переключения изотипов, Jмю-интронный энхансер и крысиный 3`-концевой энхансер) и легких цепей (4V-гена, 5 J-сегментов, константный каппа экзон, интронный и последующий энхансеры). Мыши, получившие такую конструкцию, подвергались затем инбредному скрещиванию с мышами, имеющими нарушенные собственные Ig гены.

6.2. Функционирование генов человеческих иммуноглобулинов в мышах.

Человеческие Ig гены оказались совместимыми с мышиной системой перестройки и экспрессии генов, и смогли служить заменой нарушенных мышиных генов. Человеческие иммуноглобулиновые гены из дрожжевой хромосомы оказались способными к перестройке и экспрессии независимо ни от участков их встраивания в мышиный геном, ни от количества встроенных копий. Более зависимы от расположения и количества копий оказались человеческие Ig минигены, потребовалось встраивание их множественных копий. Меньшая зависимость генов дрожжевой хромосомы от ближайшего окружения может быть следствием большого размера и структурной организованности встраиваемого генного материала, и/или следствием присутствия неидентифицированных, но важных регуляторных элементов, необходимых для оптимальной экспрессии Ig генов и их правильной регуляции.

У мышей с человеческими Ig-генами в различных лимфоидных органах (в костном мозге, селезенке, периферической крови, лимфоузлах иперитонеальной полости) были обнаружены зрелые В 220+ клетки. Все найденные В 220+ клетки экспрессировали человеческую тяжелую цепьIg, а большинство этих клеток еще и человеческую легкую цепь каппа, продуцируя при этом полные молекулы человеческих иммуноглобулинов. Меньшая часть В 220+ клеток продуцировала заменители мышиной легкой цепи класса лямбда (компоненты мышиных В-клеточныхрецепторов). Эти результаты показывают, что в процессе созревания функционально активных В-клеток тяжелые цепи человеческих иммуноглобулинов в мышах могут должным образом ассоциироваться и с заменителями мышиной легкой цепи, и с человеческими легкими цепями.

В трансгенных мышах, несущих человеческие Ig минигены, наблюдали неполное восстановление В-клеток, которое проявлялось в частичной блокировке переноса про- и пре- В-клеток из костного мозга и в низком уровне зрелых В-клеток в лимфоидных органах. Это могло быть отражением недостаточно эффективного созревания В-клеток в костном мозге на стадии перегруппировки VDJ генов из- за ограниченного репертуара введенных V-генов. Поэтому может иметь смысл вводить большее количество V-генов.

6.3. Репертуар человеческих антител в трансгенных мышах.

6.3. Репертуар человеческих антител в трансгенных мышах.

Природу репертуара человеческих антител у трансгенных мышей определяли анализом транскриптов тяжелых и каппа- легких цепей на предмет разнообразия VDJ—соединений и добавления незародышевых нуклеотидов (N-добавки). Оказалось, что в этих транскриптах все JH- иJ-каппа- сегменты были представлены с частотой, подобной той, что обнаруживается в В-клетках взрослого человека. Наблюдалось большое разнообразие использования V и D –сегментов независимо от их расположения, так же, как и в В-клетках взрослого человека. Частое добавление N- сегмента наблюдали в V-D и D-J соединениях, со средней длиной 6,1 нуклеотидов по сравнению с 7,7 нуклеотидами В-клеток взрослого человека. Длина человеческого CDR-3 (complementary determining region) тяжелой цепи варьировала от 10 до 18 аминокислот со средней длиной 12 аминокислот. CDR3 последовательность транскриптов каппа цепи была длиной в 9-10 аминокислот. Эти черты репертуара человеческих Ig, полученных от дрожжевой хромосомы, по-видимому, отражают разнообразие, наблюдающееся у взрослых людей.

В трансгенных мышах с Ig минигенами тоже наблюдали разнообразие в использовании JH- и Jкаппа- сегментов, подобное разнообразию в человеческих В-клетках. Кроме этого, наблюдали использование имеющихся VH- и вариабельных генов тяжелых и легких цепей, множественных константных регионов тяжелых цепей и добавочных регуляторных элементов. Большее разнообразие вариабельных генов может, по- видимому, повысить степень восстановления В-клеток и специфичную направленность против антигенных детерминант. Доступность различных лямбда- константных регионов позволит создать человеческие антитела с различными эффекторными функциями и поддерживать оптимальные условия созревания аффинности антител. Добавление контролирующих элементов, имеющихся в зародышевых клетках, может повысить уровень экспрессии и обеспечить оптимальное переключение изотипов, соматические гипермутации и аллельные исключения.

Линии мышей, содержащих Ig дрожжевую хромосому, могут стать бесценным источником получения терапевтических монАТ против очень широкого спектра человеческих антигенов и с разнообразной желаемой специфичностью. Кроме того, эти линии могут быть использованы для изучения молекулярных механизмов и регуляторных последовательностей, влияющих на программируемую сборку и экспрессию человеческих антител, как при нормальном иммунном ответе, так и при аутоиммунных и других заболеваниях.

Заключение.

Почти все новации в получении монАТ имели своей целью создание человеческих терапевтических антител. Впервые моноклональные антитела стали использоваться в терапии в 1986 году, но из-за своего мышиного происхождения их применение было очень ограничено. Спустя почти два десятка лет использование монАТ в терапии остается в зачаточном состоянии, несмотря на очевидные успехи в этом направлении. Большим сдерживающим фактором здесь является высокая стоимость производства терапевтических количеств моноклональных антител. Последние новости о работах по созданию трансгенных промышленных животных (коз, овец, коров), продуцирующих человеческие антитела в своем молоке, вселяют надежду на более широкое использование монАТ для лечения инфекционных, опухолевых и аутоиммунных заболеваний.