Новые методы получения моноклональных антител или их фрагментов.

Введение.

Большая часть современных исследований по получению монАТ направлена на разработку удобных и эффективных методов получения человеческих моноклональных антител или их фрагментов. В предыдущей главе подробно описывались причины, по которым предпочтительнее использовать в терапии человеческие антитела, нежели мышиные или крысиные. При получении человеческих антител первые сложности возникают уже на этапе иммунизации.

Получение иммунных В-лимфоцитов человека.

Для получения монАТ чаще всего используют В-лимфоциты периферической крови пациентов, несущих тот или иной инфекционный агент или раковую опухоль. Понятно, что специфичность антител, получаемых от таких больных, будет соответствовать их заболеванию. Для других антигенов возможна иммунизация вне человеческого организма. Более старый путь такой иммунизации- это инкубация выделенных из периферической крови лимфоцитов с антигеном, к которому хотят получить антитела (иммунизация in vitro). Во время такой инкубации часть лимфоцитов (или их предшественников) переключаются на секрецию антител против инкубируемого антигена.

Эффективность такой иммунизации очень низка, получить высокоаффинные антитела таким путем чрезвычайно сложно, поэтому позднее был разработан метод иммунизации в мышах, которым имплантировали человеческие лимфоидные ткани. Во избежание отторжения таких трансплантатов использовали мышей линии SCID, у которых отсутствует фермент, необходимый для репарации и рекомбинации ДНК. У таких мышей нарушен процесс перекомбинации иммуноглобулиновых генов, и выработка антител затруднена. Для развития полноценного иммунного ответа у таких мышей необходима трансплантация не только периферической крови, но и лимфоузлов и тимуса. Некоторые методы получения человеческих монАТ позволяют обходиться вовсе без иммунизации.

Получение бесконечно делящихся клеток-продуцентов человеческих антител (иммортализация).

Наиболее очевидный путь получения таких клеток- это гибридизация иммунных В-лимфоцитов с клетками опухолевых линий человеческой миеломы или плазмацитомы при помощи ПЭГ. Такая гибридизация используется и по сей день, но при этом эффективность слияния клеток очень низкая, а получающиеся гибридомы отличаются крайне нестабильной антителопродукцией. Объяснением этому, по-видимому, является факт несоответствия гаплотипов опухолевых клеток и гибридизируемых лимфоцитов.

Другим методом иммортализации В-лимфоцитов является их трансформация в опухолевые при помощи вирусов или онкогенов. Наиболее часто для этого используют вирус Эпштейна- Барр (ВЭБ). Мишенью ВЭБ являются В-лимфоциты человека, несущие на своей поверхности молекулы CD21. Эти молекулы присутствуют в основном на незрелых В-лимфоцитах, вовлеченных лишь в первичный иммунный ответ и не осуществивших еще переключение изотипа иммуноглобулинов. В результате трансформанты вирусом Эпштейна- Барр продуцируют, как правило, низкоаффинные антитела класса IgM. Стабильность иммуноглобулиновой секреции таких трансформантов тоже довольно низка.

Перед процедурой трансформации ВЭБ из клеточной популяции должны быть тщательно удалены все Т-лимфоциты, препятствующие трансформации ВЭБ. Несмотря на то, что более 90% всех людей являются носителями ВЭБ, при осуществлении трансформации соблюдают соответствующие предосторожности. Аналогичное воздействие на мышиные В-лимфоциты оказывает вирус мышиной лейкемии Абельсона, который и используют для трансформации мышиных клеток.

Еще одним методом иммортализации, недостаточно пока отработанным, является стимуляция роста и деления клеток добавлением в ростовую среду соответствующих лимфокинов. Для иммортализации Т-клеток таким лимфокином может служить интерлейкин 2. Для В-лимфоцитов такой лимфокин еще точно не определен, но иммортализации человеческих В-лимфоцитов можно добиться добавлением в среду клеток мышиной тимомы (линия EL4), человеческих Т-лимфоцитов, макрофагов и небольшого количества (3нг/мл) форбол миристил ацетата. Полученные таким образом долгоживущие В-лимфоциты могут секретировать антитела классов IgG, IgM и IgA.