Выделение монАТ из супернатантов гибридом и асцитных жидкостей.

При выборе методов выделения нужно учитывать следующее:

а) желаемая степень очистки в соответствии с дальнейшим использованием выделенных антител;

б) источник антител (супернатанты клеток или асцитная жидкость)

в) класс и субкласс выделяемых антител;

г) индивидуальные особенности конкретных монАТ.

Основным белком, подлежащим удалению при очистке, является альбумин (бычий в супернатантах и мышиный в асцитах). Его количество в десятки раз превосходит количество выделяемых антител.

12.1. Методы предварительной очистки антител: высаливание сульфатом аммония (натрия), преципитация каприловой кислотой, диализ против дистиллированной воды при выделении IgM.

Метод высаливания сульфатом аммония состоит в следующем: при смешивании образца антител с эквивалентным объемом насыщенного сульфата аммония происходит выпадение осадка, содержащего, главным образом, иммуноглобулины. Осадок растворяют в фосфатном буфере и диализуют. Процедуру повторяют при необходимости несколько раз. Степень очистки антител можно повысить, снижая концентрацию сульфата аммония, но при этом придется столкнуться с потерями антител. При повышении концентрации соли (до 60% от насыщения) выход антител увеличивается, но увеличивается и содержание загрязняющих компонентов, главным образом, альбумина. Недостатком метода является недостаточная степень очистки антител, поэтому часто его применяют в качестве предварительного метода, позволяющего увеличить концентрацию антител в образце.

Для очистки каприловой кислотой образец антител должен иметь рН 4, поэтому эго предварительно разбавляют 60 мМ ацетатом натрия. Каприловую кислоту добавляют по каплям при помешивании, получающийся при этом осадок содержит загрязняющие белки, IgG остается в растворе. После диализа раствор антител концентрируют и проверяют их активность.

При диализе образца против дистиллированной воды (или буфера с низкой ионной силой) большая часть IgM выпадает в осадок. Осадок растворяют в фосфатном буфере и проверяют активность антител.

12.2. Хроматографические методы выделения антител.

1) Ионнообменная хроматография.

В качестве ионнообменника для выделения антител чаще всего используют DEAE (DiEthylAminoEthyl), прикрепленного к целлюлозе, сефарозе или акриламидным гранулам. При кислых значениях рН (6,5) раствора молекулы IgG не связываются с DEAE, тогда как большинство других сывороточных (асцитных) белков (особенно, альбумин) связываются с DEAE достаточно прочно.

2) Гель-фильтрация антител производится на колонках с агарозой, сефарозой или сефадексом, если речь идет о гельфильтрации при атмосферном давлении, и акриловыми гранулами при высоко эффективной жидкостной хроматографии высокого давления (HLPC). Разделение идет по молекулярным массам белков, поэтому IgG массой 150кДа достаточно хорошо отделяется от основного загрязнителя- альбумина (65кДа).

3) Хроматография на протеинах А или G.

Протеин А (из Stafilococcus aureus) связывает Fc-фрагмент антител с разной эффективностью в зависимости от видовой и классовой (субклассовой) принадлежности антитела. Поэтому, в зависимости от силы связывания протеина А с конкретным монАТ, подбирают условия хроматографии (рН буфера для связывания, ионная сила). Антитела, плохо связывающиеся с протеином А (например, мышиные IgG1), можно выделять на протеине G.

4) Аффинная хроматография.

При помощи аффинной хроматографии, где к носителю прикреплены молекулы антигена, получаются самые чистые образцы монАТ. Однако, если монАТ имеют очень высокую аффинность, их элюция в неденатурирующих условиях может представлять серьезную проблему.

Заключение.

Гибридомная технология за 30 лет своего существования обросла многими дополнительными приемами, позволяющими получать моноклональные антитела к «сложным» антигенам. Некоторые из этих приемов запатентованы, некоторые используются лишь в тех лабораториях, которые их разработали, и недоступны всем желающим. Данное пособие отражает лишь небольшую часть всего накопленного опыта по получению гибридом, однако позволяет в общем понять смысл и значение гибридомной технологии. Для поиска путей, позволяющих получить монАТ к конкретному антигену, нужно изучать соответствующие публикации и патенты, либо самостоятельно, методом проб и ошибок, находить и отрабатывать нужные способы.