Скрининг супернатантов гибридом.

Через несколько дней после процедуры слияния заметен рост гибридомных клонов на фоне отмерших неслившихся миеломных клеток и меньших по размеру неделящихся В-лимфоцитов. На 6-14 после слияния день, когда размер клонов обычно достигает нескольких сотен клеток, необходимо протестировать супернатанты гибридом на содержание антител к требуемому антигену (иначе говоря, провести скрининг). Необходимость в раннем скрининге диктуется следующими причинами:

а) после отмирания неслившейся миеломы популяция делящихся клеток может содержать в себе гибридомы, секретирующие антитела к постороннему антигену либо антитела к требуемому антигену, но неудовлетворительной аффинности;

б) небольшая часть миеломных клеток может выжить на селективной среде вследствие обращения мутантного гена в нормальный, свободные от секреции такие ревертанты быстро перерастут гибридомы- продуценты антител;

в) после гибридизации клетки приобретают дополнительный хромосомный набор, что делает клетку генетически неустойчивой. Это приводит к активным геномным перестройкам и выбросу лишних хромосом в первые дни и недели после гибридизации. Клетка, лишившаяся таким образом обременительной для себя секреции антител, опередит в росте секретирующие клетки.

8.1.Иммуноферментный анализ.

Наиболее распространенным сегодня методом скрининга является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Общая схема имунноферментного анализа:

1) прикрепление молекул антигена на дне лунок 96-луночного планшета;

2) отмывка несвязавшегося антигена;

3) блокировка мест связывания на планшете, свободных от молекул антигена;

4) отмывка блокирующего раствора;

5) инкубация с исследуемыми образцами (например, супернатантами гибридом); в процессе инкубации должно происходить связывание молекул антигена с молекулами антител (если они имеются в исследуемом образце);

6) отмывка от несвязавшихся с антигеном компонентов исследуемых образцов;

7) инкубация с раствором конъюгированных с ферментом антител, направленных против предполагаемых антител образца;

8) отмывка от несвязавшихся конъюгированных с ферментом антител;

9) инкубация с раствором неокрашенного субстрата фермента до развития окраски вследствие ферментативной реакции;

10) остановка ферментативной реакции;

11) оценка интенсивности окраски.

Приведенная схема отражает лишь один, самый распространенный вариант иммуноферментного анализа. Рассмотрим подробнее вышеперечисленные этапы ИФА:

8.1.1. Прикрепление (сорбция) антигена.

Обычно антиген сорбируют на полистиреновых или поливиниловых 96- луночных планшетах, инкубируя раствор антигена в течение ночи при 4°С или 1-4часа при 37°С. Условия сорбции зависят от природы антигена, большинство растворимых белков хорошо сорбируется в фосфатно-солевом (рН 7,0-7,5) или бикарбонатном (рН 8,5-9,0) буфере в концентрации 1-10мкг/мл. Выбор концентрации антигена определяется его способностью неспецифически взаимодействовать с посторонними компонентами исследуемых образцов и мечеными антителами, а также доступностью антигена. Пептиды (особенно мелкие) и нуклеиновые кислоты сорбируются значительно хуже белков, а липиды возможно лишь сорбировать высушиванием их в лунках в смеси этанол/хлороформ.

Клеточные антигены и вирусные частицы можно сорбировать при обычных для белков условиях, если клетки или частицы хорошо очищены от примесей и инкубируются в достаточно высокой концентрации (10⁸ клеток/мл). В ряде случаев приходится прибегать к таким уловкам, как высушивание образцов, фиксация глутаральдегидом, сорбирование на планшеты, предварительно покрытые поли-Л-лизином, и др. Однако, если в образце слишком маленькая концентрация клеток и большое количество посторонних включений, все эти приемы оказываются неэффективными.

Низкомолекулярные соединения чаще всего нереально сорбировать обычной инкубацией, поэтому их, как правило, сорбируют в составе конъюгата с белком- носителем.

При сорбции довольно часто происходит частичное или полное искажение антигенных детерминант, иногда антитела хорошо связывают свободный и практически не узнают сорбированный антиген, но чаще наблюдается обратная картина: антитело отлично связывает сорбированный антиген и почти или совсем не узнает антиген в растворе.

8.1.2. Отмывка несвязавшихся компонентов растворов.

Отмывку планшета от несвязавшихся компонентов инкубируемых растворов проводят после каждого этапа инкубации за исключением последнего, когда планшет инкубируют с ферментными субстратами до развития окраски. Несвязавшиеся вещества отмывают обычнофосфатно- солевым буфером (ФСБ) с добавлением детергента Tween 20 при концентрации последнего 0,05-0,1%. Tween 20 уменьшает уровень неспецифических взаимодействий и способствует забивке свободных мест связывания на планшете. Обычно процедура отмывки производится заполнением лунок планшета отмывающим раствором и последующим резким вытряхиванием этого раствора из перевернутого планшета, и повторяется 3-5 раз после каждой инкубации. Сейчас рынок предлагает целый ряд приборов, частично или полностью автоматизирующих рутинную процедуру отмывки планшетов для ИФА.

8.1.3. Блокировка (забивка) несвязавшихся участков планшета после сорбции антигена.

Применение Tween делает дополнительную забивку необязательной; в тех случаях, когда Tween не используют или его блокирующие свойства не достаточны, производят инкубацию планшета с блокирующим раствором. Таким раствором может быть 0,5-1% раствор бычьего сывороточного альбумина в ФСБ, раствор желатина, казеина, овальбумина, обезжиренное сухое молоко и др. Если антиген проявляет свойства лектина, т.е. связывает определенные углеводы, необходимо добавлять в блокирующий раствор и во все растворы при последующих инкубациях (за исключением последней инкубации с ферментными субстратами) избыток этого углевода, чтобы избежать неспецифического присоединения антигена к углеводному компоненту антител.

8.1.4. Инкубирование с исследуемыми образцами.

В качестве исследуемых образцов в ИФА могут выступать супернатанты гибридом, сыворотки иммунных животных, любые растворы, которые хотят проверить на содержание антител к конкретному антигену. Инкубацию обычно проводят в течение 1 часа при 37°С, но возможны варианты.

Супернатанты можно наносить в лунки без разведения, но предпочтительнее разбавлять их в соотношении 1:1 в 1%-ом растворе БСА (бычьего сывороточного альбумина) с Tween 20 для уменьшения неспецифического взаимодействия. Если в качестве сорбированного антигена использовался конъюгат с белком носителем, супернатанты полезно наносить в растворе, содержащем избыток белка- носителя, для того, чтобы антитела против носителя с ним связались, затем отмылись и не участвовали в дальнейшем анализе. В такой системе основной вклад в формирование конечного сигнала дают антитела, направленные против гаптена (или линкера), а не носителя.

Сыворотки почти всегда тестируют, делая их серийные разведения в ФСБ-БСА-Tween. Неразведенные сыворотки содержат слишком большое количество антител и других белков, что неизбежно приведет к слишком большому уровню неспецифического связывания. Полезно параллельно с иммунной сывороткой таким же образом титровать и преиммунную, чтобы оценить уровень неспецифического связывания при каждом разведении сыворотки.

При нанесении любых тестируемых образцов на планшете для каждого антигена должны быть оставлены лунки, лишенные тестируемой пробы (отрицательный контроль). При тестировании супернатантов таких отрицательных контролей должно быть несколько: во-первых, лунка, содержащая лишь тот буфер, в котором были разведены остальные супернатанты; во-вторых, лунка, содержащая ростовую среду, разведенную этим буфером; в-третьих, лунка, содержащая супернатант иммунных В-лимфоцитов, не подвергшихся процедуре гибридизации с миеломными клетками. Постановка всех этих контролей позволит судить о том, какой вклад в формирование сигнала вносят:

а) неспецифическое связывание с антигеном антител, меченых ферментом (сигнал в лунке с буфером),

б) неспецифическое связывание компонентов ростовой среды (сигнал в лунке с ростовой средой),

в) вклад специфических к антигену антител, секретируемых неслившимися В-лимфоцитами, присутствующими в каждой лунке культурального планшета, куда высевались клетки после слияния.

Делать выводы о секреции гибридомой антител против требуемого антигена можно лишь при всех удовлетворительно низких отрицательных контролях.

В тех случаях, когда сигнал в контрольных лунках (иначе говоря, фон) слишком высок, принимают меры, позволяющие его снизить. Если «фонят» меченые ферментом антитела, снижают их концентрацию и/или меняют буфер, в котором они наносились, и условия инкубации (инкубируют при комнатной температуре вместо 37°С, используют при инкубации шейкер, сокращают время инкубации и т.д.). Иногда помогает снижение концентрации сорбированного антигена. При неэффективности этих мер пробуют использовать меченые антитела из других источников, либо другого происхождения (например, кроличьи заменяют козьими или свиными), либо несущие другую ферментную метку. Проверку меченых антител и подбор условий инкубирования производят заблаговременно.

Компоненты ростовой среды редко влияют на уровень фона, основной вклад здесь вносят белки (особенно иммуноглобулины и комплемент), содержащиеся в эмбриональной телячьей сыворотке. В таком случае обычно помогает уменьшение концентрации сорбируемого антигена.

Довольно часто высокий фон наблюдается в лунке, куда нанесли супернатант от иммунных В-лимфоцитов, не гибридизованных с миеломой. Такой фон хорошо прогнозируется по уровню титра специфических антител в сыворотке животного, используемого как источника В-лимфоцитов. Выходом здесь является смена ростовой среды во всех лунках культурального планшета, производимая столько раз, сколько требуется для удаления большей части антител, секретируемых неслившимися В-лимфоцитами.

Условия инкубации исследуемых образцов можно варьировать, если хотят повысить чувствительность метода (отношение сигнал/фон). Для уменьшения фона можно понизить температуру и уменьшить время инкубации, использовать во время инкубации шейкер, для увеличения положительного сигнала время инкубации, напротив, увеличивают. При использовании светочувствительных антигенов все процедуры ИФА проводят, по возможности, в темноте или при красном свете. В случае антигенов, не устойчивых к действию протеолитических ферментов (протеазы могут содержаться в исследуемых сыворотках и супернатантах как компоненты ростовой среды), в инкубируемые образцы добавляют ингибиторы протеаз (PMSF, aprotinin и др.).

8.1.5. Инкубирование с мечеными ферментом антителами.

Обычные условия инкубации: 1час при 37°С в фосфатно-солевом буфере. В качестве антител, конъюгированных с ферментом, обычно используют очищенную поликлональную сыворотку животных (кролика, козы, овцы, свиньи, морской свинки и др.), гипериммунизированных мышиными антителами или их фрагментами. Если для гипериммунизации берут полную иммуноглобулиновую фракцию сыворотки мыши, то получаемая поликлональная сыворотка будет узнавать все изотипы мышиных антител, с большей чувствительностью IgG1, как доминантного в мышиной сыворотке.

В случае, когда хотят получить монАТ определенного класса (например, IgG), берут поликлональные антитела, направленные против иммуноглобулинов этого класса (или подкласса). При этом, однако, возможен отбор монАТ нежелаемых классов, так как такая поликлональная сыворотка будет содержать антитела, направленные против участков, общих для разных классов иммуноглобулинов. Во избежание этого используют сыворотку против Fc-фрагментов иммуноглобулинов желаемого класса.

Качество конъюгата зависит от способа очистки поликлональных антител. При высаливании сыворотки конъюгат будет содержать помимо антител примесь других белков, а среди выделенных антител будут не только те, что направлены против иммуноглобулинов мыши, но и «посторонние» антитела, что отразится в конечном итоге на степени чувствительности анализа. При очистке с помощью хроматографии на протеине А или протеине G содержание примесных белков будет ниже, но количество «посторонних» антител будет такое же, как при высаливании. Самой качественной считается очистка аффинной хроматографией на мышиных иммуноглобулинах того класса (подкласса), против которого хотят получить конъюгат.

Все упомянутые виды поликлональных антител против иммуноглобулинов мыши сегодня представлены на рынке, при их выборе учитывают цели, для которых предполагается их использовать, желаемый уровень чувствительности ИФА и цену. Ряд лабораторий использует самостоятельно получаемые конъюгаты.

В качестве фермента для ИФА чаще всего используют пероксидазу хрена (horseradish peroxidase или HRP), реже щелочную фосфатазу или бета-галактозидазу. Пероксидаза хрена имеет несколько субстратов, все они требуют добавления Н2О2. Для ИФА чаще используют растворимые субстраты ортофенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ), причем ТМБ в последнее время вытесняет ОФД из употребления по причине канцерогенных свойств последнего. Пероксидаза хрена довольно легко конъюгируется с антителами, что, вероятно, и стало причиной ее популярности. Для конъюгирования используют, как правило, периодатный метод, при котором углеводные остатки пероксидазы соединяются с аминогруппами антител через формирование Шиффовых оснований.

При инкубации пероксидазного конъюгата нужно избегать присутствия в буфере азида натрия, ингибирующего ферментативную активность пероксидазы. Для уменьшения неспецифического связывания конъюгата с антигеном в буфер добавляют бычий сывороточный альбумин до концентрации 0,5-1% и Tween 20 (0,05%). Концентрацию конъюгата определяют экспериментальным путем:

а) в хорошо изученной системе берут оптимальное количество антигена для сорбции и насыщающее количество известных антител против антигена, параллельную дорожку оставляют без добавления антител;

б) титруют конъюгат параллельно на дорожке с антителами и на дорожке без антител;

в) считают отношение сигнала в лунке с антителами к сигналу в лунке без антител для каждого разведения конъюгата; выбирают разведение конъюгата, дающее максимальное отношение позитивный сигнал/фон и используют это разведение в дальнейшей работе. Время от времени нужно повторять процедуру определения оптимального рабочего разведения конъюгата, поскольку его активность со временем падает. О том, как нужно обращаться с фирменными конъюгатами, обычно подробно описывается в инструкциях.

8.1.6. Инкубирование с ферментными субстратами.

В настоящее время большинство лабораторий пользуется коммерческими наборами субстратов, имеющими подробные инструкции по их применению. Для пероксидазы хрена это, как правило, сухой ОФД или ТМБ, кислый буфер (цитратный для ОФД или ацетатный для ТМБ) и перекись водорода. Компоненты смешивают непосредственно перед использованием и инкубируют в лунках 10-20 минут до развития окраски (желтой в случае ОФД и голубой для ТМБ). Время инкубации может быть увеличено или уменьшено в зависимости от скорости окрашивания субстрата. Реакцию останавливают добавлением серной кислоты. Результат оценивают визуально или при помощи спектрофотометра, измеряя оптическую плотность при длине волны 492 нм (для ОФД) или 450 нм (для ТМБ).

8.1.7. Варианты иммуноферментного анализа.

Вышеописанный вариант ИФА часто хорошо работает при тестировании иммунных сывороток и супернатантов гибридом. Однако его существенным недостатком является необходимость сорбировать антиген в лунки планшета. При сорбировании антигена, как упоминалось выше, часто происходит изменение конформации антигенных детерминант, и происходит отбор монАТ, узнающих предпочтительно сорбированный антиген, а не свободный. Кроме того, для сорбции требуются значительные количества антигена, и при его дефиците имеются все основания попытаться использовать вариант ИФА с биотинилированным антигеном.

8.1.7.1. ИФА с использованием биотинилированного антигена.

Суть его заключается в следующем: На планшет сорбируют поликлональные антитела против иммуноглобулинов мыши (не конъюгированные с ферментом). Все описанные выше замечания для меченых «антимышиных» антител справедливы и в этом варианте ИФА для немеченых. После отмывки следует инкубация с супернатантами гибридом с соблюдением всех необходимых контролей. Во время этой инкубации мышиные антитела, содержащиеся в супернатантах, должны связаться с сорбированными антителами. Содержание гибридомных антител в супернатанте очень невелико по сравнению с содержанием в них других белков (особенно альбумина), поэтому напрямую сорбировать антитела на планшет в супернатантах не удается, и приходиться прибегать к помощи поликлональной гипериммунной сыворотки против мышиных антител.

После очередной отмывки в лунки планшета вносят раствор антигена, конъюгированного с биотином. При этом биотинилированного антигена требуется на порядок меньше, чем при сорбции на планшет. Во время этой инкубации гибридомные антитела должны связать антиген, а через него и биотин. При правильном конъюгировании биотина с антигеном часто (но не всегда) удается избежать изменения профиля антигенных детерминант, поэтому биотинилированный белок по своим антигенным свойствам часто ближе к нативному (природному), чем сорбированный.

Метод конъюгирования белкового антигена с биотином достаточно прост: белок должен находиться в буфере с нейтральным, а лучше сщелочным рН (скорость реакции биотинилирования возрастает с увеличением рН раствора) и в отсутствие активного азота (азид натрия или аммоний полностью блокируют реакцию). N-гидроксисукцинимидный эфир биотина растворяют в ДМСО (диметилсульфоксид) и инкубируют с раствором белка (1мг/мл) при комнатной температуре 4 часа или в холодильнике в течение ночи. Концентрацию биотина рассчитывают таким образом, чтобы на одну молекулу белка приходилось 1-20 молекул биотина (высокая степень биотинилирования увеличивает чувствительность анализа, но в то же время увеличивает риск изменения конформации антигенных детерминант белка). При использовании N-гидроксисукцинимидного эфира биотина последний присоединяется к свободным аминогруппам белка, использование других эфиров биотина позволяет присоединять его к другим группам. Реакцию останавливают добавлением азида или аммония.

Биотин имеет сродство порядка 10¹⁵М^-1 к авидину (белку куриных яиц) и стрептавидину (бактериальному аналогу авидина), поэтому следующим после очередной отмывки этапом является инкубация с авидином или стрептавидином, конъюгированными с ферментом (чаще всего с HRP). В результате выстраивается цепочка: «антимышиные» антитела- монАт из супернатанта- биотинилированный антиген- стрептавидин- пероксидаза. Следующие затем инкубация с ферментными субстратами и оценка результатов идентичны вышеописанным. Пептидные антигены тоже могут быть использованы в этой системе, но риск изменения их антигенных свойств в процессе биотинилирования довольно высок.

Этот вариант ИФА плохо подходит для тестирования иммунных сывороток по той причине, что сыворотки содержат большое количество антител, не направленных против нужного антигена. Содержание таких «посторонних» антител в иммунных сыворотках превышает содержание специфичных к требуемому антигену антител в десятки и сотни раз, поэтому в основном с связываться сорбированной поликлональной сывороткой и участвовать в анализе будут такие «посторонние» антитела. Понятно, что чувствительность этого метода для сывороток будет неудовлетворительно низкой.

8.1.7.2. Конкурентный ИФА.

Описанные выше варианты ИФА не отвечают достоверно на вопрос о том, насколько способны антитела в сыворотке или супернатанте связывать именно свободный антиген (не сорбированный, не биотинилированный, не сшитый с белком- носителем). Конкурентный ИФА решает эту задачу, хотя он несколько сложнее в исполнении по сравнению с предыдущими. Выполняется он в два этапа. Первый этап похож на ИФА, описанный в разделах 8.1.1.- 8.1.6. Цель этого этапа состоит в том, чтобы, во первых, определить содержание в сыворотке или супернатанте антител, способных связываться с сорбированным антигеном или с конъюгатом гаптен- носитель; а во- вторых, подобрать такое разведение сыворотки или супернатанта, при котором практически все антитела против антигена (даже низкоаффинные) оказываются связанными с ним, то есть нет избытка антител, оптическая плотность при таком разведении будет находиться в пределах 0,3-0,5 оптических единиц.

Второй этап конкурентного ИФА выполняется по следующей схеме:

а) Сорбируется антиген (белок или конъюгированный с носителем гаптен) при тех же условиях, что и на первом этапе.

б) После отмывки в лунки наносят смесь, состоящую из супернатанта или сыворотки, взятых в тех разведениях, которые способны давать сигнал в пределах 0,3-0,5 оптические единицы, и серийных разведений свободного антигена (белка или гаптена без носителя). Обязательно должны быть лунки, где нет добавления свободного антигена.

в) Несвязавшиеся компоненты отмывают, и затем следует инкубация с мечеными ферментом антителами против иммуноглобулинов мыши. Инкубацию с ферментными субстратами, остановку реакции и оценку результатов проводят, как описано выше.

В процессе такой инкубации со смесью исследуемого образца и свободного антигена (гаптена) происходит следующее: Антитела, содержащиеся в исследуемом образце, оказываются поставлены перед выбором: реагировать с сорбированным на планшете антигеном (конъюгатом гаптен- носитель) или со свободным, находящимся в растворе, антигеном (гаптеном). В случае, когда антитела могут узнавать свободный антиген (гаптен), они связываются преимущественно с ним, а не с сорбированным. Это происходит потому, что скорость реакции взаимодействия двух веществ, находящихся в жидкой фазе, существенно выше, чем скорость взаимодействия в системе, когда одно из реагируемых веществ сорбировано на твердофазном носителе. Связавшиеся со свободным антигеном антитела оказываются не прикреплены к планшету и отмываются при последующих отмывках. Сигнал в таких лунках получается ниже, чем в тех, в которые не добавляли свободный антиген. При последовательном повышении содержания свободного антигена в лунках сигнал последовательно снижается вплоть до уровня фона, поскольку свободный антиген конкурирует с сорбированным за связывание с антителами в пробе и не позволяет им участвовать в дальнейшем анализе.

Если в пробе будет избыток антител к антигену, то их хватит и на связывание со свободным антигеном, и на связывание с сорбированным антигеном, и конкуренцию (понижение сигнала) фиксировать будет сложно или невозможно вовсе. Поэтому здесь важно избегать избытка антител и тщательно подбирать разведения сывороток и супернатантов.

В том случае, если антитела не узнают свободный антиген (белок или гаптен), добавление его к исследуемой пробе не окажет влияния на величину сигнала, поскольку не помешает антителам реагировать с сорбированным антигеном. Часто наблюдаются промежуточные варианты, когда антитела узнают свободный антиген, но с меньшей аффинностью, чем сорбированный или в составе конъюгата с носителем. В таких случаях конкуренция имеет место, но требуются большие концентрации свободного антигена, чтобы произошло понижение сигнала, и это понижение не достигает уровня фона.

Другие варианты конкурентного ИФА используются для того, чтобы определить, связываются ли два монАТ с одним и тем же участком антигена или с разными. Для этого одно из монАТ метят конъюгированием с ферментом (или чаще с более мелким биотином) и инкубируют смесь этих монАТ с сорбированным антигеном. При этом меченое антитело берут в одной концентрации (далекой от насыщения), а второе, немеченое, наносят в серийных разведениях. При наличии конкуренции между двумя монАТ за связывание с сорбированным антигеном наблюдается понижение сигнала с увеличением концентрации немеченого антитела.

8.1.7.3.Метод «двойного сэндвича», адаптированный для скрининга сывороток и супернатантов гибридом.

Выше упоминалось о том, как полезно для разработки тест- системы иметь монАТ к разным антигенным детерминантам тестируемого антигена. При этом два монАТ не должны мешать друг другу связываться с антигеном. В случае низкомолекулярных антигенов часто отсутствует возможность получения такой «пары» антител по причине их (антигенов) мелкого размера. В случае крупных белков, вирусных частиц или бактериальных клеток получить такие «пары» и даже «тройки» антител не представляет большой сложности, не прибегая к дополнительным ухищрениям. В промежуточном положении находятся антигены, к которым получить «пару» антител возможно, но довольно проблематично: у них антигенные детерминанты либо близко расположены, либо имеется доминантная антигенная детерминанта, вызывающая на себя основной иммунный ответ. В таких случаях помогает использование при первичном скрининге метода «двойного сэндвича», адаптированного для тестирования сывороток и супернатантов.

Метод предполагает, что уже имеется одно антитело против требуемого антигена, полученное обычным способом (например, монАТпротив сильной детерминанты). Для подбора монАТ, способного образовать «пару» с уже имеющимся монАТ, неплохо работает при первичном скрининге метод «двойного сэндвича». Напомним, что при использовании этого метода одно монАТ связывают с твердофазным носителем, а второе монАТ конъюгируют с какой либо меткой и проявляют им наличие связанного с первыми монАТ антигена.

Основная проблема состоит в том, что антитела из супернатанта нельзя ни конъюгировать с меткой, ни сорбировать на твердую фазу по причине их малого содержания в супернатанте и наличия там множества «посторонних» белков. Если супернатант конъюгировать с сорбированными «антимышиными» антителами, то последние будут успешно связывать и вторые монАТ, конъюгированные с меткой. Приблизительно то же произойдет, если сорбировать уже имеющиеся очищенные монАТ, а наличие «сэндвича» сорбированные монАТ-антиген- монАТ из супернатанта проявлять с помощью конъюгированных с ферментов антител против мышиных иммуноглобулинов. Последние будут связываться с сорбированными монАТ антителами даже в отсутствие антигена и монАТ в исследуемом образце.

Избежать такого нежелательного связывания можно в том случае, если сорбировать имеющееся монАТ не целиком, а предварительно расщепив молекулу монАТ на Fab`2 и Fc- фрагменты. Имеющиеся в нашей лаборатории моноклональные крысиные антитела против мышиныхIgG не связывают такую расщепленную молекулу монАТ, поэтому метод «двойного сэндвича» для первичного скрининга мы применяли по такой схеме: В лунки планшета сорбировали полученные ранее монАТ, предварительно расщепленные на Fab\2 и Fc- фрагменты. Fab\2 –фрагмент способен связывать антиген, раствор которого инкубировали в лунках планшета после отмывки. Затем планшет снова отмывали и инкубировали с супернатантами гибридом, в которых хотели обнаружить антитела, способные реагировать с антигеном в присутствии ранее полученных монАТ. После отмывки следовала инкубация с мечеными крысиными монАТ, связывающие антитела из супернатанта, но не реагирующие с сорбированными расщепленными на Fab\2 и Fc- фрагменты моноклональными антителами.

8.1.7.3. Дот-ИФА.

Дот- иммуноферментный анализ отличается от всех описанных выше тем, что твердой фазой здесь является не планшет, а нитроцеллюлоза или фильтровальная бумага. Антиген сорбируют, нанося каплю раствора антигена на лист нитроцеллюлозы или фильтровальной бумаги. После высыхания капли процедуру при необходимости повторяют столько раз, чтобы сорбировалось достаточное количество антигена. Затем лист помещают в блокирующий раствор (1% БСА в фосфатно-солевом буфере) на ночь при 4°С или на 1 час при 37°С. После блокировки лист отмывают в фосфатно- солевом буфере с Tween 20 и инкубируют в исследуемых образцах. Все дальнейшие процедуры такие же, как и для ИФА на планшетах, за исключением ферментных субстратов.

В дот-ИФА целесообразно использовать нерастворимые в воде субстраты, такие как 4-хлор-1-нафтол и диаминобензидин тетрагидрохлорид (ДАБ), если в качестве фермента берут пероксидазу. Для получения окрашенного пятна на нитроцеллюлозе или фильтровальной бумаге эти субстраты растворяют в холодном (-20°С) метаноле (оба или один из них), затем раствор смешивают с фосфатно-солевым буфером, содержащим перекись водорода, и инкубируют в этой смеси тестируемый лист нитроцеллюлозы или фильтровальной бумаги. После окрашивания пятна в сине-черный (для хлорнафтола) и/или коричневый (для ДАБ) цвет, реакцию останавливают промыванием листа в воде.

Метод является менее удобным и чувствительным по сравнению ИФА на планшетах и для скрининга супернатантов применяется редко. Достоинствами метода являются его низкая стоимость и возможность обходиться очень маленькими объемами исследуемых проб (супернатанты можно тестировать ежедневно, нанося на пятно сорбированного антигена всего 2-5мкл супернатанта).

8.2. Радиоиммунный анализ.

Почти все сказанное выше в отношении иммуноферментного анализа можно отнести и к радиоиммуному анализу. Принципиальным отличием здесь является то, что вместо ферментной метки используют метку радиоактивную, главным образом ¹²⁵I. Наличие сигнала регистрируют, прикладывая к лункам планшета или нитроцеллюлозному листу пленку с чувствительным к излучению слоем, либо вырезают дно лунок планшета (используют специальные гибкие планшеты) или кусочки нитроцеллюлозы и фиксируют наличие излучения при помощи сцинтилляционного счетчика. Радиоиммунный анализ более чувствителен, чем иммуноферментный, однако сейчас он почти не используется по причине своей дороговизны и вредного воздействия изотопов на человека и окружающую среду.

8.3. Латекс-агглютинация и метод фиксации комплемента.

Эти методы целесообразно применять для скрининга в том случае, если получаемые монАТ предполагается использовать в подобных тест- системах. МонАТ, отобранные иммуноферментным анализом могут плохо работать в гомогенных системах, таких как латекс- агглютинация или метод фиксации комплемента.

При использовании метода латекс- агглютинации частицы латекса нагружают молекулами антигена, инкубируя их в растворе антигена 30 минут при 56°С. Латекс отмывают от несвязавшегося антигена неоднократным центрифугированием в фосфатно-солевом буфере. Тестируемые пробы смешивают со взвесью латексных частиц в лунках круглодонного 96-луночного планшета, затем центрифугируют или ждут самостоятельного осаждения латексных частиц. Наличие антител против требуемого антигена оценивают по степени агглютинации латекса: при отсутствии антител и, следовательно, агглютинации, латексные частицы собираются на дне лунки в одну точку. При наличии агглютинации частицы оказываются «размазанными» по дну лунки. Диаметр пятна зависит от степени агглютинации и, соответственно, отражает уровень содержания специфических к антигену антител в исследуемой пробе. Для облегчения визуальной оценки реакции используютярко-окрашенные латексные частицы.

Явным недостатком метода является необходимость нагревать антиген, что может привести к изменению его антигенных свойств. Другим недостатком метода является необходимость тщательного подбора условий реакции для каждого конкретного антигена во избежание ложно-положительных реакций. К таким условиям относятся: количество сорбируемого антигена и разведение супернатантов и сывороток, поскольку избыток сывороточных неспецифических антител (особенно класса IgM) может вызвать неспецифическую агглютинацию. Кроме того метод c большей чувствительностью определяет антитела класса IgM по сравнению с более желаемыми IgG. К несомненным достоинствам метода можно отнести быстроту его исполнения и низкую стоимость.

Метод фиксации комплемента имеет много общего с латекс-агглютинацией; разница состоит в том, что антигеном нагружают не латексные частицы, а живые клетки (как правило, эритроциты барана). Взвесь клеток с молекулами антигена на поверхности смешивают с исследуемой пробой и раствором белков системы комплемента. При наличии в пробе антител к антигену, происходит активация комплемента и, как следствие, лизис клеток, наблюдаемый визуально. Достоинства и недостатки метода фиксации комплемента те же, что и у латекс-агглютинации.

8.4. Дополнительные методы скрининга.

При получении монАТ полезно учитывать их предполагаемое использование и в связи с ним вводить дополнительные методы скрининга, позволяющие отобрать монАТ, максимально пригодные для их применения. Примером здесь может быть скрининг монАТ,влияющих на активность фермента, либо обладающих самостоятельной ферментативной активностью. В этих случаях используют метод, позволяющий оценивать активность фермента в присутствии или в отсутствие тестируемого образца.

Клонирование гибридом.

Сразу после обнаружения в лунке с растущим клоном (или несколькими клонами) желаемых антител, нужно возможно скорее провести клонирование. Причины, по которым нужно торопиться с клонированием, такие же, что и для раннего тестирования первичных клонов, и были перечислены выше.

9.1. Метод клонирования в мягком агаре.

Отцы гибридомной технологии Келер и Мильштейн в своей пионерской работе использовали метод клонирования в мягком агаре. Сегодня этот метод имеет скорее историческое, нежели практическое значение, но из уважения к патриархам гибридомной технологии кратко рассмотрим и его. Гибридомы после процедуры слияния высевали в чашке Петри на стерильном 1%-ом агаре, приготовленном на селективной ростовой среде с аминоптерином. Белые бляшки растущих клонов тестировали на наличие специфических антител, используя метод фиксации комплемента. Те бляшки, вокруг которых наблюдали лизис эритроцитов барана, вырезали скальпелем, клетки суспендировали в ростовой среде и затем вновь высевали на агар. Процедуру повторяли до тех пор, пока не отбирали клоны, стабильно продуцирующие нужные антитела. Такие антитела являются моноклональными, поскольку секретируются клоном, выращенным из одной клетки.

9.2. Клонирование методом предельных разведений.

Самым распространенным сегодня методом клонирования является метод предельных разведений. Смысл его состоит в том, чтобы суспензию клеток развести в ростовой среде до такой концентрации, чтобы при посеве клеток на планшет в каждой лунке оказалась бы одна гибридомная клетка. На практике такое недостижимо, даже при самом тщательном расчете в какие-то лунки попадет две или даже большее число клеток, в какие-то не попадет вовсе. Кроме того, не все клетки могут выжить в тяжелых для них условиях одиночества и дать начало жизнеспособному клону. Поэтому делают несколько разных разведений клеток (как правило, три), в первом из них концентрацию клеток берут приблизительно равной 10 клеток на лунку, во втором- одна клетка на лунку, и в третьем- 0,1 на лунку. Приведенные цифры в разных пособиях могут варьировать. Клетки высевают, используя фидерный слой клеток, поскольку у одинокой гибридомной клетки практически нет шансов выжить в лунке.

Через несколько дней просматривают под микроскопом все лунки и фиксируют количество растущих в них клонов. Лунки с одним растущим клоном осматривают особенно тщательно на предмет отсутствия в них вторых мелких и малозаметных клонов. Затем, когда клоны достигнут достаточного для тестирования размера, проводят скрининг их супернатантов, используя тот же метод, что и для тестирования первичных клонов. Среди клонов, давших при тестировании положительный результат, отбирают самые продуктивные и здоровые на вид и повторяют процедуру клонирования. Если после второго клонирования все протестиро