Основные этапы получения моноклональных антител методом гибридомной технологии.

Долгое время единственным источником монАТ были опухолевые линии антитело- продуцирующих клеток миеломы и плазмацитомы, выделенные из больных людей и животных. Такие клетки могли быть адаптированы к росту в культуральных средах и секретировать моноклональные антитела, но было очень трудно и зачастую даже невозможно определить антиген, к которому эти антитела были направлены. Понятно, что использование таких монАТ было очень ограничено. Ситуация кардинально изменилась в 1975 году, когда ученые Kohler иMilshtein предложили метод получения моноклональных антител предопределенной специфичности, за что позднее были удостоены Нобелевской премии.

Смысл гибридомной технологии заключается в создании гибридной клетки (получившей название «гибридома»), получаемой путем слияния антитело- продуцирующего В-лимфоцита и опухолевой клетки миеломного или плазмацитомного ряда. (Рис.4). Такая гибридома обладает свойством секретировать антитела, взятой у В-лимфоцита, и способностью к бесконечному делению, взятой у опухолевой клетки.

Источником В-лимфоцитов для получения гибридомы служат лимфоидные органы животного, гипериммунизированного тем антигеном, против которого хотят получить монАТ. Гипериммунизация сильно повышает процентное содержание В-лимфоцитов, продуцирующих антитела желаемой специфичности, в общей популяции клеток лимфоидного органа. Лимфоциты, выделенные из тканей селезенки,лимфоузлов, периферической крови, не способны к самостоятельному делению и живут в культуре всего 10-14 дней. Миеломные клетки, напротив, могут жить и делиться в культуре сколь угодно долго, но не продуцируют антитела нужной специфичности (чаще используют линии миелом или плазмацитом, вообще не продуцирующие никаких антител).

В результате процедуры гибридизации (слияния) образуется гетерогенная популяция клеток, состоящая, во-первых, из неслившихсяклеток лимфоидного органа; во-вторых, из неслившихся клеток миеломы; в-третьих, из гибридов лимфоцит+лимфоцит и миелома+миелома; в четвертых, из гибридов лимфоцит+миелома, из которых лишь часть (часто весьма небольшая) стабильно продуцирует антитела нужной специфичности. Понятно, что необходимо отделить интересующие клетки от всех остальных. От неслившихся лимфоцитов и гибридовлимфоцит+лимфоцит избавляться не нужно: через несколько дней они умрут сами; от неслившихся опухолевых клеток и гибридов миелома+миелома избавляются с помощью селективных сред (подробности ниже); среди оставшихся клеток (гибридов лимфоцит+миелома) отбирают нужные путем клонирования, когда из одной клетки выращивают популяцию клеток (клеточный клон) и отбирают среди таких клонов лишь те, которые стабильно продуцируют антитела требуемой специфичности.

Секрецию антител определяют различными методами скрининга супернатантов гибридом, другими словами, проводят анализ тойкультуральной среды, в которой рос конкретный клон. При наличии в супернатанте желаемых антител проводят еще одно или несколькоклонирований, затем клетки нарабатывают для получения большего количества антител либо в культуре, либо в перитонеальной полости мышей (крыс). Далее антитела выделяют из культуральной или асцитной жидкости и проводят более детальные исследования на предмет их пригодности для использования в тех целях, для которых монАТ были получены. Клетки–продуценты можно заморозить и хранить в жидком азоте долгое время.

 

 

Рассмотрим теперь подробнее каждый из этапов получения монАТ:

Иммунизация.

Иммунизация- самый «творческий» этап в процессе получения моноклональных антител, именно эффективностью иммунизации определяется в наибольшей степени конечный успех всего предприятия. Тут невозможно дать какой-то единый рецепт, поскольку выбор схемы иммунизации и использование различных приемов, повышающих эффективность иммунизации, целиком зависят от свойств конкретного антигена.

3.1.1.Выбор объекта иммунизации.

В первую очередь необходимо выбрать объект иммунизации. На сегодняшний день известны три вида гибридомных систем: мышиная, крысиная и человеческая. Самой распространенной сегодня является мышиная гибридома, а самая редкая- человеческая, чему имеется ряд причин:

а) Мыши- наиболее хорошо изученный и доступный объект для работы в лаборатории, то же относится и к линиям мышиных миелом, используемых для слияния.

б) Все линии крысиных миелом, адаптированные для гибридомных работ, запатентованы, поэтому коммерческое использование крысиных гибридом регламентируется соответствующими патентами. Все мышиные линии миелом свободны от патентных ограничений.

в) Гипериммунизацию грызунов провести проще, чем иммунизацию человека. В большинстве случаев гипериммунизация человека вообще невозможна по этическим соображениям.

г) Источником иммунных В-лимфоцитов грызунов могут служить ткани любых лимфоидных органов, тогда как у человека возможно лишь взять периферическую кровь, где общее содержание В-лимфоцитов не превышает 20% от всех клеток. В редких случаях можно использовать удаленные миндалины пациентов, где содержание В-лимфоцитов может достигать 60%, но они, как правило, инфицированы и секретируют антитела именно против этого инфекционного агента.

д) При получении человеческой гибридомы существует проблема гистосовместимости клеток миеломы и В-лимфоцитов: у грызунов для слияния берутся В-лимфоциты и клетки миеломы, полученные от одной линии животных, и поэтому имеющих сходный репертуар антигенов гистосовместимости на клеточных поверхностях. Для человека это условие недостижимо, что в конечном итоге выражается очень низкой эффективностью слияния и крайне нестабильной антителопродукцией человеческих гибридом.

е) Мышиные и крысиные антитела достаточно просто нарабатывать в асцитных жидкостях; для человеческих гибридом возможна наработка лишь в культуре, либо с применением генноинженерных методов.

Для иммунизации мышей чаще всего используют линию BALB/c, все линии мышиных миелом происходят от этой линии. В случае низкоиммуногенных антигенов можно попытаться иммунизировать мышей другой линии, к некоторым антигенам они дают более сильный иммунный ответ по сравнению с BALB/c. Наработку таких гибридом в асцитных жидкостях производят на потомках первого поколения, полученных от скрещивания BALB/c и линии, использованной для иммунизации.

Для иммунизации крыс литература настойчиво рекомендует линию LOU/C, но вполне удовлетворительные результаты получаются с более доступными в нашей стране крысами линии WISTAR.

4.1.Схемы иммунизации мышей.

4.1.1.Короткая схема иммунизации.

Наиболее любима нашей лабораторией короткая схема иммунизации, когда антиген вводят дважды с двухнедельным интервалом в подушечки задних лап. Количество вводимого антигена берут в пределах от 5 до 200мкг на мышь в зависимости от его доступности и иммуногенности, для токсичных антигенов доза может быть понижена до 0,1мкг. Для первого введения антигена (раунда иммунизации) раствор антигена объемом 50-200 мкл смешивают с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), представляющего собой минеральное масло совзвесью убитых микобактерий. При активном перемешивании раствора антигена с ПАФ получается мелкодисперсная эмульсия, призванная замедлить и пролонгировать поступление антигена в ткани. Считается, что убитые микобактерии усиливают иммунный ответ, что, однако, у многих исследователей вызывает сомнение. Второй раунд иммунизации проводят так же, как и первый, но с использованием неполного адъюванта Фрейнда (НАФ), в котором отсутствуют микобактерии.

В случае проблемных антигенов полезно иммунизировать группу животных разными дозами антигена и с использованием разных схем иммунизации. На третий или четвертый день после второго раунда иммунизации нужно взять пробы крови и проанализировать их на содержание антител против требуемого антигена. Для дальнейшей работы выбирают животное с максимальным титром, исключение составляют антигены- белковые токсины, где иногда высокий титр специфических антител сочетается с большим процентом убитых токсином В-лимфоцитов. В таких случаях нужно брать животное, имеющее не самый высокий титр и/или обращать внимание на жизнеспособность клеток, берущихся для слияния.

На четвертый день после второго раунда иммунизации животное забивают, и клетки подколенных лимфоузлов сливают с клетками миеломы.

4.1.2. Длинные схемы иммунизации.

В случае неэффективности короткой схемы иммунизации пробуют различные виды длинных схем. При этом обычно животных иммунизируют с интервалом 2-4 недели либо внутрибрюшинно, либо подкожно (реже внутривенно или орально), используя для первого раунда иммунизации ПАФ, а для последующих- НАФ.

На 10-14 день после каждого раунда иммунизации (начиная со второго) кровь иммунизируемых животных проверяют на содержание специфических антител. Если титр антител достиг желаемого уровня, проводят последний раунд иммунизации (называемый бустированием), вводя раствор антигена внутривенно без адъювантов, в количестве 1/10 от предыдущих доз. В результате бустирования избирательно стимулируются клоны, продуцирующие антитела высокой аффинности к антигену.

4.2. Некоторые приемы, позволяющие усилить иммунный ответ.

4.2.1. Конъюгация (химическая сшивка) низкомолекулярного антигена (гаптена) с белком- носителем.

Существует целый ряд низкомолекулярных соединений, не способных самостоятельно вызвать иммунный ответ по причине малого размера молекулы. В таких случаях гаптен конъюгируют с белком- носителем (часто в качестве белка- носителя берут бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин или гемоцианин улитки) и такой конъюгат используют для иммунизации. При этом возникает целый ряд проблем:

а) Основной иммунный ответ будет направлен на белок- носитель, а не на молекулу гаптена, и это нужно будет учитывать при тестировании сывороток иммунизируемых животных и супернатантов гибридом. Тестирование должно отражать содержание антител именно к гаптену, а не к конъюгату в целом.

б) Пространственное строение гаптена (конформация), как правило, существенно изменяется в процессе конъюгирования с носителем, иногда настолько, что все антитела против участков гаптена, находящегося в составе конъюгата, не способны узнавать свободную молекулу гаптена. В таких случаях пробуют разные варианты конъюгирования, которые затрагивают при сшивке разные функциональные группы молекулы гаптена, либо используют разные «линкеры»- органические соединения, связывающие функциональные группы гаптена и белка- носителя и увеличивающие экспонированность гаптена на поверхности носителя.

В целом метод конъюгирования хорошо зарекомендовал себя при получении антител против низкомолекулярных соединений.

4.2.2. Иммунизация иммунными комплексами (антиген- антитело).

Метод применяют, когда антигеном является консервативный низкоиммуногенный белок, либо, когда хотят получить антитела против минорных антигенных детерминант, на которые при иммунном ответе направлен очень низкий процент всех специфических антител. В первом случае антительным компонентом иммунного комплекса могут служить монАТ с неудовлетворительной аффинностью, полученные ранее после обычной иммунизации. Во втором случае берут монАТ против сильных антигенных детерминант, получение которых не представляет большой сложности.

Примером успешного использования такого подхода может служить получение антител против человеческого эритропоэтина, α и γ интерферонов, иммуноглобулинов близкородственных видов (крысиные монАТ против IgG мыши).

4.2.3. Конъюгация с адъювантным белком (hsp70).

Встречаются антигены, которые в силу своей сверх-консервативности не способны вызвать сколько-нибудь заметный иммунный ответ, несмотря на свою белковую природу и достаточный молекулярный вес (например, гемоглобин, некоторые ферменты). Выходом здесь может стать конъюгирование их с белком теплового шока (heat shock protein 70kDa, hsp70). Имеются данные, что hsp70 облегчает презентацию пептидных фрагментов, экспонируя их определенным образом, на практике же конъюгирование белков и пептидов с hsp70 приводит, как правило, к резкому усилению выработки антител против этих белков и пептидов.

Однако, случается полное подавление иммунного ответа в результате конъюгирования с hsp70, которое мы неоднократно наблюдали при иммунизации конъюгатом hsp70- интерферон γ.

4.3. Предварительная обработка антигенов перед иммунизацией.

а) Токсичные антигены часто подвергают денатурации нагреванием или добавлением денатурирующих агентов (мочевины, гуанидилхлорида и др.). Токсичность при этом снижается (не всегда), но утрачиваются многие антигенные детерминанты, присущие неденатурированному (нативному) антигену. В результате получаемые монАТ узнают лучше денатурированный антиген.

б) Иногда молекулы антигена сшивают друг с другом (полимеризуют) с целью увеличения молекулярного веса и/или уменьшения токсичности.

в) Вирусы и бактерии перед иммунизацией, как правило, инактивируют нагреванием, либо обработкой фенолом, формальдегидом, глутаральдегидом и др. для уменьшения их токсичности и эпидемиологической опасности. Грамотрицательные бактерии, кроме того, иногда обрабатывают лизоцимом, чтобы убрать ЛПС с их поверхности и обеспечить иммунный ответ против бактериальных белков.

5. Гибридизация В-лимфоцита с клеткой миеломы.

Отцы гибридомной технологии Келер и Мильштейн добивались слияния клеток при помощи вируса Сендай. Сейчас для этой цели все используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), как более удобное, эффективное и безопасное средство. Формула ПЭГ:

HO(CH2CH2O)n CH2CH2OH, молекулярный вес ПЭГ, пригодного для слияния, от 20 до 20000, но чаще используют ПЭГ массой 600-6 000.

Полиэтиленгликоль токсичен для клеток, и его токсичность возрастает с уменьшением молекулярного веса. Слияние клеток происходит во время инкубации их в 35-50% ПЭГ, время инкубации зависит от концентрации ПЭГ и от его молекулярного веса (для 50% ПЭГ мол. веса 1 500 это приблизительно 1 минута). Недостаточное время инкубации приведут к очень низкому проценту слившихся клеток, а избыточное- к большому проценту погибших клеток вследствие токсичности ПЭГ. Хорошо работает такой компромиссный вариант, когда клетки сначала инкубируются при мягком перемешивании в 50% ПЭГ в течение 1 мин, затем процент ПЭГ снижается до 35% медленным добавлением бессывороточной среды, и клетки инкубируются еще 5-7 минут. Затем медленно, но с нарастающим темпом и при аккуратном перемешивании суспензия клеток далее разбавляется средой, потом центрифугируется и высевается на культуральные планшеты.

Точный механизм гибридизации клеток еще недостаточно изучен. Вначале, по-видимому, происходит агглютинация (склеивание) клеток, затем слияние клеточных мембран и, наконец, слияние ядер и перестройки хромосомного материала. Имеются данные, что сливаются, в основном, клетки, находящиеся в стадии интенсивного деления. По этой причине клетки миеломы за 12-24 часа до гибридизации переводят в условия, способствующие максимальной скорости роста клеток (повышение содержания фетальной сыворотки, витаминов и ростовых факторов в культуральной среде). Иммунизация в свою очередь стимулирует рост клонов В-лимфоцитов- продуцентов специфических к антигену антител.

Культивирование клеток.

Обычные условия культивирования миеломных и гибридомных клеток- 37°С и 5% СО2. Основа культуральной среды- это разные варианты предлагаемых на рынке сред DMEM или RPMI 1640, представляющих собой раствор солей, аминокислот, витаминов, углеводов и питательных добавок в разных концентрациях и цветового индикатора кислотности (как правило, феноловый красный). Кроме этого к среде добавляют эмбриональную телячью сыворотку или ее синтетические или полусинтетические заменители до концентрации 3-20% как источник белка и ростовых факторов. Качество сыворотки в наибольшей степени влияет на скорость роста клеток, особенно гибридомных, как более капризных по сравнению с миеломными. Помимо сыворотки в среду добавляют пируват натрия, антибиотики, глутамин (если он не содержался в исходной среде), реже- оксалоацетат, бета-меркаптоэтанол, инсулин и др.

Для культивирования клеток при низкой клеточной плотности (особенно при клонировании, когда из одной- единственной клетки в лунке необходимо вырастить целый клон) используют так называемый фидерный слой клеток (или просто фидер), облегчающий эту задачу. Клетки фидера не должны самостоятельно делиться, они призваны обеспечивать гибридомные клетки необходимыми для роста цитокинами и создавать клеточные контакты. В качестве фидера можно использовать клетки тимуса, селезенки, лимфоузлов, перитонеальной полости животных того вида, который использовался для получения иммунных В-лимфоцитов. Фидер от животных другого вида тоже может быть использован, но с меньшей эффективностью.

Культивирование клеток необходимо проводить в условиях, максимально приближенных к стерильным. Попавшие в культуру клеток бактерии и грибы, опережая гибридомы в скорости роста, очень быстро исчерпают питательные вещества ростовой среды и насытят ее своими токсинами. Это приведет к неизбежной гибели гибридомных клеток. Во избежание инфицирования пользуются стерильными ростовыми средами и стерильной культуральной посудой, применяют антибиотики, а все манипуляции с клетками проводят в условиях минимальной осемененности микробами (в ламинарном боксе с принудительной подачей стерильного воздуха).

Особую проблему представляет заражение клеток внутриклеточными паразитами- вирусами и микоплазмой. Детектировать их достаточно сложно, они, как правило, не убивают всю культуру гибридомных клеток и с легкостью переносятся от одной культуры к другой. Вирусы и микоплазма фильтруются сквозь бактериальные фильтры, поэтому фильтрование ростовых сред и воздуха в ламинарном боксе становятся неэффективными при борьбе с ними. Заражение клеток вирусами или микоплазмой приводит к резкому замедлению роста клеток, особенно в малой их плотности, а также к усиленной потере гибридомами их способности секретировать антитела. Против микоплазмы существуют специальные антибиотики, а против вирусов- интерфероны, но они помогают лишь снизить степень инфицированности клеток, не избавляя их от инфекции полностью. Более действенным является сочетание антибиотиков с неоднократным проведением зараженной культуры через организм животного, где клетки могут расти в виде асцитной жидкости и использовать иммунную систему животного против инфекции.