Техника посевов микроорганизмов

Посевы проводят как с целью выделения возбудителей из исследуемого материала от больных, так и для получения чистых культур с целью последующего их изучения и идентификации.

Техника посевов в жидких и на плотные питательные среды имеет свои особенности. В левую руку берут две пробирки. В одной находится питательная среда (плотная или жидкая), в другой – исследуемый материал. Пробирки зажимают большим и указательным пальцами. Для того, чтобы можно было наблюдать за содержанием пробирок, их держат сверху кисти руки. Пробирки должны быть наклоненными, и нужно следить, чтобы при открытии в них не попали посторонние микробы или материал с окружающих предметов. Пробки из пробирок вынимают, держа их четвертым и пятым пальцами правой руки. Тремя другими пальцами правой руки, как карандаш, держат бактериологическую петлю или пипетку, которыми распределяют исследуемый материал. Сначала стерилизуют (прокаливают) петлю в верхней части пламени газовой горелки. Пробирки открывают, и край их проносят через пламя горелки.

Петлю опускают в пробирку, где есть исследуемый материал, и, осторожно касаясь стенки, охлаждают. В последующем петлю опускают в пробирку и набирают материал. Если он находится в жидком состоянии, для посева достаточно капли жидкости, которая задерживается в кильке бактериологической петли. Когда используют микробов, которые выросли на поверхности среды, осторожно плавным движением набирают небольшое количество их, следя, чтобы не повредить питательную среду.

Петлю медленно вынимают из пробирки, не касаясь ее стенок, и переносят в другую пробирку со средой. Штриховыми движениями от одной стенки пробирки к другой, начиная с нижней части среды, проводят материал по скошенной поверхности агара снизу вверх. Петлю вынимают из пробирки, пробки и края пробирок проносят через пламя и закрывают. Петлю стерилизуют в пламени, чтобы уничтожить микроорганизмы. При посеве материала на жидкую питательную среду петлю с материалом окунают в жидкость. Если он не снимается из петли, его осторожно растирают на стенке пробирки и омывают средой.

Материал, который набирали пастеровской или градуированной пипеткой, выливают в питательную среду, а для равномерного распространения его пробирку осторожно, чтобы не замочить пробку, стряхивают или вращают, зажав в ладонях.

Посев тампоном

 При посеве тампоном чашку открывают одной рукой, тампоном касаются поверхности агара возле края чашки и начинают проводить посев штрихами от края к краю чашки, втирая осторожно материал в поверхность среды, не повреждая его, постепенно вращая тампон. После проведения посева чашку вращают на 90° и повторяют посев перпендикулярно к предыдущему.

При посеве уколом в столбик питательной среды пробирку с мясо-пептонним агаром, желатином и т.п. берут в левую руку, петлю с материалом – в правую и делают укол к дну пробирки в среду. Петлю осторожно вынимают, а пробирку закрывают.

Посев материала в толщу питательной среды

Перед посевом материал должен быть в жидком состоянии. Стерильной градуированной пипеткой набирают 0,1, 0,5 или 1,0 мл материала и выливают его в стерильные чашки Петри. После этого материал заливают 15−20 мл растопленного и охлажденного до 45−50 °С МПА. Осторожно покачивая чашку, круговыми движениями по поверхности стола перемешивают в ней материал, достигая его равномерного деления в среде. Чашку оставляют закрытой до полного застывания агара, а затем переворачивают вверх дном.

Для того, чтобы выделить чистую культуру микроорганизмов, следует отделить многочисленные бактерии, которые находятся в материале, одна от другой. Это можно достичь с помощью методов, которые основаны на двух принципах – механическом и биологическом разобщении бактерий.

 

  30. Принципы и методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты —биовары.

Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами

по антигенным свойствам — сероварами

по чувствительности к фагу—фаговарами.

Культуры микробов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирку с твердой или, реже, жидкой питательной средой.

Колония - изолированное скопление бактерий одного вида, или биовара, выросших на плотной питательной среде в результате размножения одной или нескольких бактериальных клеток. Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей морфологии, цвету и другим признакам.

Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований, которые заключаются в идентификации, т. е. определении родовой и видовой принадлежности выделенных бактерий. Это достигается путем изучения их морфологических, культуральных, биохимических, антигенных, токсикологических свойств.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуют питательные потребности, условия и тип роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Эти свойства устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические признаки бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах.

Для идентификации бактерий до рода и вида имеют значение пигменты, окрашивающие колонии и культуры в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens (палочка чудесной крови), золотистый пигмент—Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент—Pseudomonas aeruginosa (палочка синезе-леного гноя).

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выполнению соответствующего маркера — определению фермента, антигена, чувствительности к фагам.

Принципы выделения чистых культур:

1) механическое разобщение бактерий. Цель-получение отдельных колоний бактерий (метод Дригальского с последующим высевом чистых культур).

2) принцип, основанный на биологических свойствах бактерий:

а) прогревание для выделения культур спорообразующих бактерий

б) обработка кислотой или щелочью для выделения культур кислото-щелочеустойчивых бактерий.

в) посев по Шукевичу для выделения культуры подвижных бактерий.

г) применение элективных, селективных сред.

д) использование чувствительных лабораторных животных.

 

Микрофлора тела человека в различные возрастные периоды. Роль микробов – постоянных обитателей тела человека в физиологических процессах. Понятие о дисбактериозе, его классификация, проявления и методы лечения. Пробиотики, пребиотики.

Нормальная микрофлора подчиняется ряду основных закономерностей:

l представлена доминантными видами и видами-наполнителями;

l преобладающими являются анаэробные бактерии;

l она образует биопленку (полисахаридный каркас, состоящий из микробных полисахаридов и муцина)

l достаточно стабильна.

Состав нормальной микрофлоры:

• постоянная (резидентная) микрофлора представлена относительно стабильным составом микроорганизмов, обычно обнаруживаемых в определенных местах тела человека у людей определенного возраста;

• транзиторная (временная) микрофлора попадает на кожу или слизистые оболочки из окружающей среды, не вызывая заболеваний и не обитая постоянно на поверхностях тела человека. Она представлена сапрофитными условно-патогенными микроорганизмами.

Состав транзиторной микрофлоры может меняться в зависимости от:

• возраста;

• условий внешней среды, труда, рациона питания;

• перенесенных заболеваний;

• травм и стрессовых ситуаций.

Нормальная микрофлора взрослого:

• Облигатная микрофлора составляет около 90 - 95% (облигатные анаэробы):

– бифидобактерии

– бактероиды

– катенобактерии

• Сопутствующая (факультативная) микрофлора составляет 5 - 10% (факультативные анаэробы):

– лактобактерии

– эшерихии

– энтерококки

• Остаточная микрофлора (около 1%):

– клостридии

– стафилококки

– протей

– синегнойная палочка

– клебсиеллы

– энтеробактер

– цитробактер

– дрожжеподобные грибы и др.

Значение норм микрофлоры:

1)Участие в колонизационной резистентности

• Колонизационная резистентность - это совокупность механизмов нормальной микрофлоры и макроорганизма, предотвращающих колонизацию слизистых оболочек патогенными микроорганизмами.

• Со стороны нормальной микрофлоры колонизационная резистентность обеспечивается антагонистической активностью по отношению к патогенным микроорганизмам.

• Антагонизм микроорганизмов - это сложное взаимоотношение, когда при совместном развитии популяций бактерии одного вида угнетают развитие других, а иногда полностью их уничтожают.(конкуренция за рецепторы связывания и блокада адгезии и колонизации слизистых патогенными и условно-патогенными микробами)

• Участие в синтезе витаминов группы В, К, фолиевой, никотиновой и аскорбиновой кислот.

• Участие в метаболизме желчных кислот, жиров, холестерина, жирных кислот.

• Участие в расщеплении целлюлозы и других сложных органических веществ.

• Участие (прямое и опосредованное) во всасывании железа (антианемическое влияние), кальция и витамина Д (антирахитическое влияние).

• Стимуляция перистальтики кишечника за счет ферментации белков до индола, скатола и фенола и за счет образования кислот.

• Детоксикационное, антиканцерогенное действие.

• Стимуляция местного и общего иммунитета (является источником хронического «физиологического воспаления»).

• Могут вызывать эндогенную инфекцию (на фоне иммунодефицита, при попадании в непривычные места обитания)

Возрастные особенности:

Полость рта эмбриона обычно стерильна.

Первичное инфицирование происходит при прохождении через родовые пути.

Через 4-12 часов после родов полость рта колонизируют:

● бифидобактерии;

● кишечная палочка;

● энтерококки;

● зеленящие стрептококки (Streptococcus salivarius);

● Staphylococcus epidermidis;

● Corynebacterium pseudodiphtheriticum;

● Candida albicans.

Через несколько недель полость рта колонизируют:

● анаэробные бактерии;

● спирохеты;

● лактобациллы (1 % от общего количества);

● нейссерии (3-5 %).

При прорезывании зубов – обильный рост анаэробов и появление простейших.

С возрастом увеличивается содержание анаэробных бактерий, лактобацилл,

стафилококков, кандид и простейших.

Потеря зубов в пожилом возрасте приводит к значительному уменьшению

содержанию облигатных анаэробов, интенсивной колонизации бактериями из ЖКТ.

ЖКТ новорождённого можно считать стерильным (12-16 часов после

родов).

В течение первой недели внеутробной жизни - интенсивная колонизация:

● Lactobacillus bifidus (у естественно вскармливаемых детей);

● Lactobacillus acidophilus (у детей находящихся на искусственном

вскармливании);

● кишечными палочками;

● энтерококками;

● стафилококками;

● бифидобактериями (преобладают);

● спорообразующими анаэробами;

● эшерихиями;

● Грам- аэробами.

К первому году жизни состав микрофлоры здорового ребенка

практически идентичен микрофлоре здорового взрослого человека.

Дыхательные пути

Верхние отделы дыхательных путей у новорождённых обычно

стерильны и колонизируются в течение 2~3 сут бактериями:

● негемолитическими и зеленящими стрептококками;

● непатогенными нейссериями;

● стафилококками;

● энтеробактериями;

● менингококками;

● пневмококками;

● пиогенными стрептококками.

По мере взросления, совершенствования защитных

механизмов вероятность носительства патогенных бактерий

снижается; у подростков и взрослых их находят сравнительно

редко.

Кожа:

Первичная колонизация кожных покровов

плода происходит при родах, но эта микрофлора (фактически

флора родовых путей матери) в течение недели

замещается следующими

бактериями:

● Staphylococcus epidermidis;

● Micrococcus spр.;

● Sarcina spp.,

● Аэробные и анаэробные дифтероиды;

● Staphylococcus aureus;

● гемолитические и негемолитические стрептококки.

Дисбактериоз

• клинико-лабораторный синдром, возникающий при ряде заболеваний и клинических ситуаций, характеризующийся изменением качественного и/или количественного состава нормальной микрофлоры, метаболическими и иммунными нарушениями, сопровождающимися у части больных клиническими проявлениями

Классификация:1. По этиологии:

а) Дисбактериоз здоровых лиц:

– Сезонный

весна, лето, осень – снижение числа бифидобактерий и эшерихий

– Возрастной

снижение к старости бифидобактерий, бактероидов

– Пищевой

однообразная пища приводит к снижению количества анаэробов и кишечной палочки

– Профессиональный

работа в замкнутых пространствах (космонавты, подводники, зимовщики полярных станций), работники пищевой промышленности и др.

б) Дисбактериоз больных:

• Инфекционные и паразитарные болезни

• Заболевания ЖКТ неинфекционной природы

• Заболевания печени и желчевыводящих путей

• Онкопатология

• Постстрессорные дисбактериозы (травмы, ожоги, инфаркт и др.).

в)Медикаментозные дисбактериозы:

• После антибактериальной терапии

• После химиотерапии онкологических заболеваний

• После лечения иммунодепрессантами

г)Пострадиационный (лучевой) дисбактериоз

д)Дисбактериоз смешанной этиологии

2. По фазам развития (по А.Ф. Билибину):

1) Начальная фаза – характеризуется увеличением общего количества симбионтов в тех местах, где они обитают.

2) Фаза нарушения взаимоотношений между представителями нормальной микрофлоры (снижение количества одних симбионтов и преобладающий рост других), а также появление таких представителей, которые в норме не выявляются или выявляются в незначительном количестве.

3) Фаза изменения обычной локализации тех или иных представителей нормальной микрофлоры (появление эшерихий в полости рта, проксимальных отделах кишечника и др.), развитие бактериемии представителями нормальной микрофлоры (при травмах, ожогах и др.).

4) Фаза появления токсигенных, вирулентных, патогенных свойств у представителей нормальной микрофлоры (гемолитическая кишечная палочка), появление патогенных микроорганизмов (токсигенные стафилококки, шигеллы, сальмонеллы и др.).

Лечение:

• селективная деконтаминация патогенной и условно-патогенной микрофлоры кишечника:

– бактериофаги(Бактериофаг протейный жидкий (Протеофаг),Коли-бактериофаг жидкий (Колифаг)

– кишечные антисептики (интетрикс, эрсефурил)

– антибактериальные препараты

• коррекция нормальной микрофлоры кишечника:

– пребиотики

– пробиотики

• функциональное питание:

употребление кисломолочных и других продуктов с включением в них в качестве активного действующего начала бифидобактерий

• коррекция моторно-секреторной функции ЖКТ:

– ферментотерапия

– поливитаминотерапия

– спазмолитики

– антидиарейные препараты

– желчегонные препараты

• энтеросорбция и энтеропротекция:

карболен (активированный уголь), полифепан (растительный энтеросорбент), смекта, полисорб и др.

Пребиотики—это препараты немикробного происхождения, вызывающие селективную стимуляцию роста или усиления метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника.

К пребиотикам относятся углеводы (с бета-гликозидными связями), которые обладают одновременно двумя важными свойствами:

1) не перевариваются и не всасываются в верхних отделах пищеварительного тракта;

2) селективно ферментируются микрофлорой толстой кишки, вызывая активный рост полезных микроорганизмов

Наиболее распространённые:

•лактулоза (димер из фруктозы и галактозы)

•инулин (полимер из D-фруктозы)

•олигофруктоза

Пробиотики-это живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения позитивные эффекты на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма хозяина через стабилизацию и оптимизацию функции его нормальной микрофлоры. (! СОЗДАЮТ УСЛОВИЯ ДЛЯ СОБСТВЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ)

• Различают:

– бифидо-содержащие препараты

– лакто-содержащие препараты

– коли-содержащие препараты

– препараты из непатогенных представителей рода Bacillus

• Группы препаратов-пробиотиков:

1. Монокомпонентные

2. Поликомпонентные

3. Комбинированные