Культуры клеток. Классификация клеточных культур. Питательные среды для культур клеток. Методы индикации вирусов в культуре клеток.

Способы культивирования вирусов

· Организм лабораторных животных

· Куриные эмбрионы

· Культуры клеток

Типы культур клеток

· Первично-трипсинизированные

· Полуперевиваемые

· Перевиваемые

Первично-трипсинизированные культуры- фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных. Их получают из клеток различных тканей путем размельчения и трипсинизации. Используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.

Полуперевиваемые -пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило не более 50 пассажей (теряют исходные свойства). Для их получения используют диплоидные клетки легких человека. Используют для диагностических целей.

Перевиваемые линии – способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам; источником является опухолевая ткань и эмбриональные клетки; способны к бесконечному размножению; нельзя использовать для производства вакцин.

Перевиваемые культуры клеток

¨ HeLa — линия перевиваемых клеток, которая была получена в 1951 году из раковой опухоли шейки матки пациентки по имени Генриетта Лакс (англ. Henrietta Lacks), умершей от этого заболевания

¨ Hep-2 – линия перевиваемых клеток рака гортани человека

¨ Hep-3 – линия перевиваемых клеток лимфоидной карциномы человека

¨ McCoy – перевиваемая культура синовиальных клеток человека

Питательные среды для культур клеток включают большой набор различных факторов роста:

среда 199 (66 компонентов)

среда Игла (28 компонентов)

раствор Хенкса

Кроме факторов роста в среды добавляют индикатор (феноловый красный), который помогает контролировать жизнеспособность клеток: живые клетки выделяют кислые продукты метаболизма, поэтому среда закисляется и приобретает жёлтый цвет. Это значит, что среду нужно поменять. Если клетки гибнут, цвет среды остаётся красным.

Питательные среды для культур клеток

· Синтетические (ср. 199, раствор Хенкса) – содержат микроэлементы и витамины. Используют для поддержки жизнидеятельности.

· Полусинтетические – содержат гидрализаты различных продуктов. Используют для роста.

· Натуральные (естественные) сыворотки крупного рогатого скота или фетальные.

Индикация:

На эмбрионе:

· По реакции гемагглютинации (РГА),

o Используется только для индикации вирусов, содержащих гемагглютинины

o Ставится в лунках планшета

o Компоненты:

§ жидкая питательная среда, в которой культивировали культуру клеток,

§ взвесь эритроцитов

o Учет – по характеру осадка эритроцитов:

§ при наличии вируса с гемагглютининами – “зонтик”,

§ при отсутствии – “пуговка”.

o Если вирус обнаружен, то жидкость называется вируссодержащей жидкостью (ВСЖ)

· Реакция имуноферментативная (ИФА)

· РИФ

На клеточной культуре:

· По цитопатическому действию (ЦПД-видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов (пикноз ядер, просветы в монослое))

· По выявлению специфических вирусных включений. скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании

· Реакции имунофлюоресценции (РИФ)

· Реакция гемадсорбции(РГАдс)

o Используется только для индикации вирусов, содержащих гемагглютинины

o Компоненты:

§ культура клеток

§ взвесь эритроцитов (наносится на клетки культуры), инкубация, промывка, окраска.

o Учёт – световая микроскопия

o При наличии вируса с гемагглютининами на поверхности клеток видны эритроциты, при отсутствии – эритроцитов нет.

· По изменению цвета индикатора питательной среды (199) – цветная проба.

· Метод электронной микроскопии

· Образование симпластов в культурах клеток под влиянием вирусов

· Бляшки» или «негативные» колонии. Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тонким слоем агара. После инкубирования посевов в течение нескольких суток на агаровом покрытии появляются просветленные участки определенной формы (бляшки), представляющие собой участки погибших клеток в сплошном монослое клеточной культуры. Каждая бляшка образуется при размножении одной вирусной частицы и хорошо заметна в виде круглого светлого участка на красном фоне клеток, прижизненно окрашенных нейтральным красным.

· «Цветная» проба Солка Оценивается по изменению цвета индикатора (феноловый красный), находящегося в питательной среде культивирования. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и, соответственно, цвета индикатора

(среда становится желтой). При репродукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный цвет (красный). Данная проба подходит к вирусам с коротким периодом репродукции.

На животных:

· По клинической симптоматике

· По специфическим изменением клеток

· По включениям методом РИФ

24. Морфология, ультраструктура и химический состав фагов. Этапы репродукции фагов. Различия между вирулентными и умеренными фагами.

Бактериофаги (фаги) — вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки.

СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ:

1) ГОЛОВКА (в полости головки нах-ся ДНК, покрытая тонкой белковой оболочкой- капсидом). Если на головке имеются выступы (волоски)- «волосистый фаг»

2) СТЕРЖЕНЬ - хвостовой отросток (полая трубка, одетая сокращающимся «чехлом». Ч/з стержень в бак. кл. поступает ДНК (или РНК) фага. На конце фага имеется фермент ЛИЗОЦИМ..

3) ВОРОТНИЧОК

4) БАЗАЛЬНАЯ ПЛАСТИНКА с шипами-ч/з отверстие в баз. пл. проходит стержень. Шипы- для прикрепления фага к рецепторам клетки. Сокращение отростка и впрыскивание НК стимулируется базальной мембраной

5) ФИБРИЛЛЫ (5 длинных нитей) служат для «узнавания» участков на поверхности бактерий, к которым прикрепляется фаг.

ПО МОРФОЛОГИИ ФАГИ:

1) нитевидные, без видимой головки

2) фаг с аналогом отростка

3) фаг без отростка

4) фаг с коротким отростком

5) фаг с несокращающимся чехлом у отростка

6) фаг с сокращающимся чехлом у отростка

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ФАГОВ:

-белок (50 -60%)

-ДНК (40 -50%),

-липиды, углеводы (небольшие количества)

-лизоцим, гиалуронидаза (на конце стрежня)

ГЛАВНЫЕ СВОЙСТВА ФАГОВ:

1) СПЕЦИФИЧНОСТЬ — способность взаимодействовать с определенным видом микроорганизмов.

2) АДАПТАЦИЯ — способность при пассировании лизировать близко родственных микробов.

3) ЛИТИЧЕСКАЯ или лизогенная активность (вызывать растворение бактерий или фагоносительство).

4) РЕЗИСТЕНТНОСТЬ — устойчивость к действию радиации, хранению в лиофильно высушенном виде (но быстро гибнут от дезинфектантов, кипячения, кислот).