Антигенная структура бактериальной клетки: О -, К -, Н – антигены. Групповые и видовые антигены микробов.

В структуре бактериальной клетки различают жгутиковые, соматические, капсульные и некоторые другие антигены. Жгутиковые, или Н-антигены, локализуются в локомоторном аппарате бактерий — их жгутиках. Они представляют собой эпитопы сократительного белка флагеллина. При нагревании

флагеллин денатурирует, и Н-антиген теряет свою специфичность. Фенол не действует на этот антиген.

Соматический, или О-антиген, связан с клеточной стенкой бактерий. Его основу составляют ЛПС. О-антиген проявляет термостабильные свойства — он не разрушается при длительном кипячении. Однако соматический антиген подвержен действию альдегидов (например, формалина) и спиртов, которые нарушают его структуру.

Капсулъные, или К-антигены, располагаются на поверхности клеточной стенки. Встречаются у бактерий, образующих капсулу. Как правило, К-антигены состоят из кислых полисахаридов (уроновые кислоты). В то же время у бациллы сибирской язвы этот антиген построен из по-липептидных цепей. По чувствительности к нагреванию различают три типа К-антигена: А, В, и L. Наибольшая термостабильность характерна для типа А, он не денатурирует даже при длительном кипячении. Тип В выдерживает непродолжительное нагревание (около 1 часа) до 60 "С. Тип L быстро разрушается при этой температуре. Поэтому частичное удаление К-антигена возможно путем длительного кипячения бактериальной культуры.

На поверхности возбудителя брюшного тифа и других энтеробактерий, которые обладают высокой вирулентностью, можно обнаружить особый вариант капсульного антигена. Он получил название антигена вирулентности, или Vi-антигена. Обнаружение этого антигена или специфичных к нему антител имеет большое диагностическое значение.

Видовые антигены (Аг) представлены антигенными детерминантами, присутствующими у особей одного вида. Отдельные штаммы микроорганизмов могут содержать внутривидовые Аг, по которым их разделяют на серологические варианты (серовары).

Групповые антигены (Аг) представлены антигенными детерминантами, обусловливающими внутривидовые различия у особей одного вида, что позволяет разделять их на группы.

55. Антитела (иммуноглобулины), их структура. Классы иммуноглобулинов, их функции.

Антитела – это особый класс гликопротеидов, обладающих иммунной функцией (т.е. их синтез индуцируется антигенами и основным их свойством является способность к специфическому взаимодействию с антигенами).

По растворимости – это глобулины (глобулиновая фракция белков)

По электрофоретической подвижности – гамма-глобулины

По специфичности к определенномуантигену – антитела

По наличию иммунной функции - иммуноглобулины

Функции антител:

1. Распознавание антигенов

2. Нейтрализация токсинов

3. Блокирование вирусов и бактерий

4. Комплекс «АГ-АТ» запуск системы комплемента по классическому пути

5. Опсонизация микроорганизмов

6. Усиление киллинга АГ

7. Выведение из организма

8. Удаление иммунологических комплексов

Строение антитела:

Молекула Ig- состоит из двух идентичных, тяжелых цепей Н и 2-х легких L цепей которые соединяются между собой дисульфидными мостиками. Структурной единицей Ig являетмся мономер состоящий из 2 Н и 2 L цепей. Среди него различают вариабельную часть и константную часть. Вариабельная часть Н и L цепей составляют фаг-фрагмент к которому присоединяется антиген (2 штуки) специфичность этой связи носит название аффиности антитела, скорость и прочность связи определяет авидность. Константный фрагмен – отвечает за неспецифические функции антител: связь с комплементом, связь с фагоцитами, тучными клетками.

 

Иммуноглобулины по структуре, антигенным и иммунобиологическим свойствам разделяются на пять классов: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Иммуноглобулин класса М. Наиболее крупная молекула из всех Ig. Различают подтипы Ml и М2. Синтезируется предшественниками и зрелыми В-лимфоцитами. Обладает высокой авидностью, наиболее эффективный активатор комплемента по классическому пути. Участвует в формировании сывороточного и секреторного гуморального иммунитета. Не проходит через плаценту. IgM обеспечивает нейтрализацию, опсонизацию и маркирование антигена, осуществляет запуск комплемент-опосредованного цитолиза и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности.

Иммуноглобулин класса G. Различают подтипы Gl, G2, G3 и G4. Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами и плазматическими клетками. Хорошо определяется в сыворотке крови на пике первичного и при вторичном иммунном ответе. Легко проходит через плацентарный барьер и обеспечивает гуморальный иммунитет новорожденного в первые 3—4 месяца жизни. Способен также выделяться в секрет слизистых, в том числе в молоко путем диффузии. IgG обеспечивает нейтрализацию, опсонизацию и маркирование антигена, осуществляет запуск комплемент-опосредованного цитолиза и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности.

Иммуноглобулин класса А. Существует в сывороточной и секреторной формах.

Сывороточный IgA: Различают подтипы А1 и А2. Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами и плазматическими клетками. Хорошо определяется в сыворотке крови на пике первичного и при вторичном иммунном ответе. Обладает высокой аффинностью. Может быть неполным антителом. Не связывает комплемент. Не проходит через плацентарный барьер. IgA обеспечивает нейтрализацию, опсони-зацию и маркирование антигена, осуществляет запуск антителозависимой клеточно-опос-редованной цитотоксичности.

Секреторный IgA: Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами и их потомками — плазматическими клетками соответствующей специализации только в пределах слизистых и выделяется в их секреты. Секреторная форма IgA — основной фактор специфического гуморального местного иммунитета слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы и респираторного тракта. Он препятствует адгезии микробов на эпителиальных клетках и генерализации инфекции в пределах слизистых.

Иммуноглобулин класса Е. Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами и плазматическими клетками преимущественно в лимфоидной ткани бронхолегочного дерева и ЖКТ. Не связывает комплемент. Не проходит через плацентарный барьер. Обладает выраженной цитофильностью — тропностью к тучным клеткам и базофилам. Участвует в развитии гиперчувствительности немедленного типа — реакция I типа.

Иммуноглобулин класса D. Сведений об Ig данного изотипа не так много. Не связывает комплемент. Не проходит через плацентарный барьер. Является рецептором предшественников В-лимфоцитов.

 

 

56. Сероиндикация инфекционных заболеваний. Серологические реакции применяемые для сероиндикации их компоненты и учет.
Сероиндикация - обнаружение возбудителя непосредственно в исследуемом материале от больного при помощи иммунных диагностических сывороток. При постановке серологической реакции в направлении сероиндикации от больного берется исследуемый материал, в составе которого находится предполагаемый возбудитель (АГ). В лаборатории необходимо иметь иммунную диагностическую сыворотку, содержащую специфические известные AT.

Любая серологическая реакция протекает в две фазы:

1 - специфическая фаза - соединение АГ бактерий с AT, содержащимися в иммунной сыворотке (невидимая фаза реакции);

2 - неспецифическая фаза - образование видимогоневооруженным глазом изменения (осадка, кольца, гемолоза и т.д.).

Для диагностики инфекционных заболеваний чаще всего используются следующие реакции: реакция агглютинации (РА), реакция непрямой гемаг- глютинации (РНГА), реакция преципитации (РП), реакция флокуляции (РФ), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция нейтрализации (РН) экзотоксинов и вирусов.

СЕРОИНДИКАЦИЯ

Много АТ: РПГА, РП, РА, РФ, РСК, РИФ, РИА, ИФА, РН ИФА, РН

Неполные АТ: РИФ, ИФА, РИА, Р.Кумбса

Реакции агглютинации (РА)

Реакция агглютинации – это специфическая серологическая реакция взаимодействия АГ и АТ, протекающая в присутствии электролита, с образованием комплексов (в виде хлопьев или зёрен), выпадающих в осадок.

Условия постановки РА:

· АГ должен быть корпускулярным;

· АТ должны быть полными;

· В среде, где проводится реакция, должен быть электролит (чаще всего в его роли используется 0,9% - ный р-р NaCl).

Фазы РА

1. Специфическая (невидимая)

Не видна невооруженным глазом и состоит в специфическом взаимодействии АТ с АГ детерминантами, расположенными на поверхности бактерий и других корпускулярных частиц.

2. Видимая

Заключается в неспецифической агрегации комплексов «АГ-АТ», образованных в первую фазу, с образованием конгломератов и выпадении последних в осадок в виде хлопьев или зерен агглютината. Эта фаза видна невооруженным глазом и протекает лишь в присутствии электролита (0,9 %-ный р-р NaCl).

Классификация РА

По способам постановки:

· Пластинчатая (ставится на плоскости: на предметном стекле, планшете и т.д.);

· В пробирках (развёрнутая РА);

· В лунках планшета (развёрнутая РПГА).

По характеру компонентов:

· Прямая РА (АТ напрямую взаимодействуют с АГ);

· Непрямая (пассивная) РА (например, РПГА, реакция латекс-агглютинации, реакция коагглютинации, когда некорпускулярный АГ или АТ зафиксированы на носителе: эритроцитах человека или барана, частицах латекса, клетках стафилококков и т.д.).

Реакция агглютинации (РА) на плоскости (пластинчатая РА)

Используется в диагностике инфекционных заболеваний (сероидентификация) для определения вида, серогруппы или серовара выделенной чистой культуры бактерий с помощью специфических агглютинирующих сывороток (то есть на 3 этапе бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний) – в данном случае АГ – чистая культура бактерий. Также прямая РА применяется для определения

групповой принадлежности крови по системам AB0 и Rh. Здесь в роли АГ выступают эритроциты пациента. Ставится реакция на плоскости (предметное стекло, специальный пластиковый планшет и т.д.). На предметное стекло наносят раствор АГ и агглютинирующую диагностическую сыворотку (заведомо известные АТ против определённых АГ). Учет визуальный. В случае положительной реакции (АТ связались с АГ) в капле регистрируется появление хлопьевидного или зерновидного осадка, в случае отрицательной (АТ не связались с АГ) – отсутствие осадка.

Развёрнутая РА

Применяется в серодиагностике инфекционных заболеваний (для обнаружения неизвестных АТ в сыворотке крови пациента и определения их титра). Ставится в пробирках. Перед началом реакции сыворотка крови пациента титруется, т.е. готовится ряд её последовательных разведений. В каждую пробирку помещают сыворотку крови пациента и диагностикум (заведомо известный АГ). Учёт визуальный. Положительная реакция – осадок в виде хлопьев или зерен, отрицательная – отсутствие осадка. Количество АТ в сыворотке крови определяется величиной их титра. Титр – это предельное (максимальное) разведение сыворотки крови пациента, при котором реакция еще положительная. Диагностический титр – это величина титра АТ, при которой можно поставить серологический диагноз заболевания. Как правило, в практической медицине определяют титр АТ в динамике заболевания (в «парных» сыворотках, т.е. минимум 2 раза): первый раз – при поступлении пациента в инфекционный стационар, второй – через 7-10 дней. Диагностически значимым является четырёх- и более кратное нарастание титра АТ.

Реакции непрямой (пассивной) агглютинации

Если осуществляется работа с мелкодисперсными АГ, то применяют реакцию непрямой (пассивной) агглютинации. В данном случае для лучшей визуализации реакции АГ или АТ предварительно адсорбируют на носителе: эритроцитах человека или животного, микросферах латекса, клетках стафилококков и т.д. (АГ мелкий, поэтому при взаимодействии с «чистыми» АТ результат реакции визуально будет не виден). Этот вариант РА является боле чувствительным, чем прямая РА, то есть позволяет определить АГ или АТ в исследуемых образцах в меньших количествах.

Пластинчатая РПГА

Применяется в диагностике инфекционных заболеваний (сероиндикация) для определения возбудителей по антигенным свойствам в исследуемом материале с помощью диагностических сывороток. Ставится на предметном

стекле. Компоненты реакции: исследуемый материал и диагностическая сыворотка (суспензионные антитела). Учёт реакции визуальный. В случае положительной реакции АТ связываются с АГ и образуется хлопьевидный осадок. При отрицательной реакции не происходит связывания АТ с АГ и осадка не будет.

Реакции латекс-агглютинации и коагглютинации

Применяются в диагностике инфекционных заболеваний (реакции сероиндикации и в сероидентификации). Напоминают пластинчатую РПГА, но известные АТ адсорбированы не на эритроцитах, а либо на микросферах латекса (реакция латекс-агглютинации), либо на клетках стафилококков (реакция коагглютинации).

Развёрнутая РПГА

Используется в серодиагностике инфекционных заболеваний (определяют наличие конкретных АТ в сыворотке крови пациента и их титр). Ставится в лунках планшета. Компоненты реакции: раститрованная сыворотка крови пациента и эритроцитарный диагностикум. Учёт визуальный. Положительная реакция – осадок в виде «зонтика», отрицательная – в виде «пуговки». Определяют титр АТ в сыворотке крови пациента, а также динамику изменения титра в течение заболевания как в развёрнутой РА.

Реакция Кумбса

Является разновидностью РА. Используется для обнаружения неполных АТ (например, антиэритроцитарных при резус-конфликтной беременности) в сыворотке крови пациента (женщины). Неполные АТ, имея только один антигенсвязывающий центр, не могут вызвать видимую агглютинацию при взаимодействии с АГ. Поэтому реакцию проводят в 2 этапа: 1) Добавление к сыворотке крови пациентки стандартных резус-положительных эритроцитов и связывание ими неполных антиэритроцитарных АТ; 2) Добавление антиглобулиновой сыворотки (содержит АТ против человеческих иммуноглобулинов). АТ, содержащиеся в антиглобулиновой сыворотке, связывают неполные АТ, фиксированные на поверхности эритроцитов, вызывая видимую глазом агглютинацию эритроцитов. Положительная реакция свидетельствует о наличии в сыворотке крови пациентки неполных антиэритроцитарных АТ.

Оставить место (1 страница) для пояснений и рисунка

Реакции преципитации (РП)

По условиям постановки РП напоминает РА.

Отличия РП от РА:

· АГ в РП должны быть мелкодисперсными, растворимыми;

· Положительным результатом реакции преципитации является

образование зоны помутнения в месте эквивалентных соотношений АГ

и АТ;

· Образовавшийся комплекс может быть растворён в избытке АГ или АТ;

· Большая чувствительность РП по сравнению с РА (позволяет определять АГ или АТ в образцах в минимальных, следовых количествах).

Классификация РП

По способам постановки выделяют:

· РП в жидкой фазе;

· РП в твёрдой фазе.

Реакции преципитации в жидкой фазе

1. Реакция кольцепреципитации

Эта качественная реакция применяется в сероиндикации для обнаружения АГ возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале – реакция термокольцепреципитации Асколи (АГ – соматический О-АГ возбудителя сибирской язвы), либо в судебной медицине для определения видовой принадлежности крови или других биологических жидкостей (АГ – белковые молекулы плазмы крови и прочих биологических жидкостей).

Ставится в узких преципитационных пробирках. В пробирки вносят преципитирующую сыворотку и затем, держа пробирку в наклонном положении, аккуратно по стенке наслаивают поверх сыворотки раствор АГ. Учёт визуальный по обнаружению кольца преципитации (зоны помутнения) на границе между диагностической сывороткой и раствором АГ. В случае положительной реакции (АТ диагностической сыворотки подошли к АГ) регистрируется кольцо преципитации, при отрицательной (АТ диагностической сыворотки не подошли к АГ) кольца преципитации не будет.

2. РП с нефелометрическим учётом

В отличие от реакции кольцепреципитации – это количественная реакция, позволяющая определить количество АГ в той или иной биологической жидкости (например, гормонов, ферментов, онкомаркеров и т.д.) или АТ

(классов A, M, G, E или против определённых возбудителей инфекционных заболеваний) в сыворотке крови пациента. В пробирках смешиваются оптимальные разведения АГ и АТ. Учёт проводят с помощью нефелометра (прибор, измеряющий степень мутности раствора, которая будет прямопропорциональна количеству АГ или АТ в исследуемом образце). Количество АГ или АТ определяют при помощи калибровочной кривой, которую строят предварительно для растворов с известным содержанием АГ и АТ (стандартов). Калибровочная кривая – это график, отражающий зависимость степени мутности раствора от содержания АГ или АТ в образце.

Реакции преципитации в твёрдой фазе

1. РП в геле (двойная иммунодиффузия)

Реакция применяется в сероидентификации для определения токсигенности выделенной чистой культуры Corinebacterium diphtheriae. В центр чашки Петри с питательной средой укладывается полоска фильтровальной бумаги, пропитанная противодифтерийной антитоксической сывороткой, затем перпендикулярно к ней штрихами засевают чистые культуры коринебактерий. Учёт реакции визуальный по обнаружению мутных дуг («усов») преципитации. Если чистая культура коринебактерий токсигенная (т.е. продуцирует дифтерийный экзотоксин), то между полоской фильтровальной бумаги и чистой культурой бактерий образуются дуги преципитации. В противном случае дуг преципитации не будет.

Оставить место (6-7 см) для рисунка и пояснений

2. Радиальная иммунодиффузия по Манчини

Применяется для определения количества иммуноглобулинов классов A, M, G, Е в сыворотке крови пациента. На поверхность стеклянной пластины наносят слой агара, смешанного с диагностической сывороткой, содержащей АТ против человеческих иммуноглобулинов соответствующего класса. Далее в первые четыре лунки, вырезанные в агаре, вносят стандарты (стандартная сыворотка крови, содержащая растворы иммуноглобулина в известных концентрациях), в остальные – исследуемую сыворотку крови пациентов. Искомые иммуноглобулины из лунок диффундируют в агар, образуя в зоне эквивалентных соотношений со стандартными АТ против них кольца преципитации, диаметр которых тем больше, чем больше содержится соответствующих АТ в сыворотке крови пациента. По стандартам строится калибровочная кривая, то есть график, в котором определённому диаметру кольца преципитации соответствует конкретный уровень иммуноглобулина в сыворотке крови. Измеряя диаметры колец вокруг лунок с исследуемыми сыворотками крови пациентов, по калибровочной кривой определяют

уровень иммуноглобулинов определённого класса в сыворотке крови пациента.

Оставить место (0,5 страницы) для рисунка и пояснений

3. Иммуноэлектрофорез

Применяется для определения белкового состава плазмы крови человека (иммуноэлектрофореграмма белков плазмы крови), а также в фармации с целью определения присутствия примесей в белковых препаратах. В первом случае АГ – определённый белок плазмы крови пациента, во втором – белковые молекулы в составе фармпрепарата (в том числе примесные).

Ставится на стеклянной пластине с нанесённым на нее агарозным гелем. В геле вырезают лунки, в которые помещают АГ, затем проводят электрофорез, в результате чего АГ разделяются и упорядочиваются в соответствии с величиной своей молекулярной массы. Далее в канавки, вырезанные параллельно движению АГ, вносят диагностические сыворотки (содержат АТ к АГ, помещённым в лунки). В зонах соответствия АГ и АТ образуются дугообразные линии преципитации, причём каждому АГ соответствует своя дуга преципитации.

Оставить место (1 стр.) для рисунков.

Реакции иммунофлуоресценции (РИФ)

Заключается в использовании АТ или (реже) АГ, меченных молекулами флуорохрома (флуоресцирующего красителя). В качестве флуорохромов чаще всего используют флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) – краситель зелёного цвета или родамин – красно-оранжевого. Меченые АТ связываются с искомыми АГ и заставляют их светиться при облучении лазером или ультрафиолетовыми лучами, что позволяет зарегистрировать результат реакции. По способам постановки выделяют прямую и непрямую РИФ.

1. Прямая РИФ

Применяется в сероиндикации, в диагностике вирусных инфекций, иммуногистохимических исследованиях (определение типов клеток по составу их рецепторного аппарата, рецепторов к гормонам и т.д.), а также составляет основу CD-типирования (подсчёт числа иммунокомпетентных клеток в крови по их CD-рецепторам). Неизвестный АГ (патоген или клетка макроорганизма) обрабатывается специфической люминесцирующей сывороткой. После инкубации во влажной камере (15 минут, 37°С) проводят промывание буферным раствором для удаления несвязавшихся компонентов. Учёт реакции осуществляют при помощи люминесцентного микроскопа (обнаружение светящихся комплексов в поле зрения) или проточного цитометра (прибор оценивает интенсивность свечения, которая тем больше, чем больше АГ содержится в образце).

Оставить место (0,5 стр.) для рисунков.

СD-типирование

Рецепторы, локализующиеся на поверхности иммунокомпетентных клеток, получили наименование CD (англ. «cluster of differentiation»), причём конкретные рецепторы присутствуют только на поверхности определённых клеток. Например, маркер CD19 характерен только для B-лимфоцитов, а CD3 – для Т-лимфоцитов и т.д. И если мы, используя меченые АТ против, например, CD19, выявим наличие этого рецептора на поверхности клетки, то можно сказать, что это В-лимфоцит.

2. Непрямая РИФ

Применяется, в основном, в серодиагностике, а также для определения количеств иммуноглобулинов классов M, G, A, E и аутореактивных антител в сыворотке крови пациента. Сыворотку крови пациента, содержащую неизвестные АТ (например, против АГ определённых возбудителей), сначала добавляют к известным АГ (диагностикумам), инкубируют во влажной камере (15 минут, 37°С) и промывают буферным раствором для удаления несвязавшихся компонентов. Далее вносят антиглобулиновую сыворотку (АГС), содержащую АТ против человеческих иммуноглобулинов крови, меченные ФИТЦ. Инкубируют, промывают. Учёт проводят с помощью люминесцентного микроскопа, либо проточного цитометра.

.

Проточная цитометрия

Представляет собой современный высокотехнологичный метод, позволяющий быстро определять многие характеристики клеток, такие как: размер, гранулярность цитоплазмы, экспрессия рецепторов, внутриклеточные цитокины, интенсивность апоптоза и т.д. Проточная цитометрия широко используется в клинической практике для определения количества иммунокомпетентных клеток, а также различных молекул в крови и других биологических жидкостях. Также этот метод широко применяется в онкогематологии для определения клеточного типа лейкозов.

Принцип метода. К цельной крови или выделенным клеткам добавляют определённую диагностическую люминесцирующую сыворотку, после чего пробу помещают в проточный цитометр. В основе проточной цитометрии лежит принцип гидродинамического фокусирования: по проточной ячейке с определённой скоростью движется поток изотонического раствора. В ячейку через зонд подаётся образец и в результате разности гидродинамического давления в зонде и проточной ячейке происходит фокусирование струи в струе и клетки крови выстраиваются друг за другом в ряд. В определённых местах проточную ячейку пересекает луч лазера, молекула флуорохрома

переходит в возбуждённое состояние и испускает собственную флуоресценцию, интенсивность которой регистрируется специальными датчиками. Полученные данные отображаются на дисплее в виде графика (гистограммы).

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Принцип метода напоминает РИФ, но вместо флуоресцирующей метки используется ферментная (чаще фермент пероксидаза).

1-ый вариант ИФА (направлен на обнаружение антигенов)

Цели постановки:

1. Сероиндикация (АГ – молекулы на поверхности бактериальных клеток или вирусных частиц);

2. Идентификация вирусов (на третьем этапе вирусологического метода диагностики);

3. Определение уровней цитокинов, белков системы комплемента, онкомаркеров в сыворотке крови (в данном случае АГ – это сами молекулы цитокинов, онкомаркеров, белков системы комплемента и т.д.);

4. Иммуногистохимические исследования (определение специфических рецепторов на поверхности клеток тканевых срезов – антигенов).

Ставится такой вариант ИФА в лунках планшета, ко дну которых заранее адсорбированы известные АТ против определённых АГ. Вносят исследуемый образец, инкубируют в шейкере, промывают буферным раствором. Далее в лунки вносят вторые антитела, меченные ферментом, вновь инкубируют в шейкере и промывают. После второй отмывки в лунки вносят субстрат-индикаторную систему, состоящую из субстрата для пероксидазы (перекись водорода) и цветового индикатора (например, ТМБ – тетраметилбензидин – окрашивает образец в синий цвет или ОФДА – ортофенилендиамин – окрашивает образец в коричневый цвет). Останавливают реакцию добавлением стоп-реагента (слабый раствор соляной или серной кислоты). Учёт реакции – по измерению оптической плотности содержимого лунок планшета с помощью спектрофотометра или ИФА-анализатора. Количество АГ в образце определяется по калибровочной кривой (график, где определённому содержанию АГ соответствует определённое значение оптической плотности раствора, измеряемое спектрофотометром или ИФА-анализатором). Калибровочные кривые строят предварительно по стандартам (фабричные растворы, содержащие заведомо известное количество того или иного АГ).

2-ой вариант ИФА (направлен на выявление антител)

Цели постановки:

1. Серодиагностика (определение количества АТ против бактериальных, вирусных, протозойных, грибковых АГ в сыворотке крови);

2. Определение уровней иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови и других биологических жидкостях;

3. Определение уровней аутоагрессивных антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях (используется в диагностике аутоиммунных заболеваний).

При таком варианте ИФА к дну лунок планшета адсорбированы известные АГ (диагностикумы) к ним добавляют сыворотку крови пациента. (биологическую жидкость). Инкубируют в шейкере, промывают. Далее в каждую лунку вносят антиглобулиновую сыворотку (АГС), содержащую АТ к человеческим иммуноглобулинам, меченные пероксидазой, инкубируют в шейкере, затем промывают и вносят субстрат-индикаторную систему. Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента (слабый раствор соляной или серной кислоты). Учёт реакции – с помощью спектрофотометра или ИФА-анализатора по измерению оптической плотности содержимого лунки планшета. Количество АТ в сыворотке крови определяется по калибровочной кривой (график, где определённому содержанию АТ соответствует определённое значение оптической плотности раствора, измеряемое спектрофотометром или ИФА-анализатором). Калибровочные кривые строят предварительно по стандартам (фабричные растворы, содержащие заведомо известное количество тех или иных АТ).

Реакция связывания комплемента (РСК)

Используется, в основном, в серодиагностике инфекционных заболеваний, в том числе для определения титра АТ в сыворотке крови пациента. Ставится в пробирке. В первой пробирке готовят «рабочую систему», состоящую из сыворотки крови пациента (для определения титра АТ сыворотку крови титруют), диагностикума и стандартного комплемента (получен из сыворотки крови морских свинок). Заметим, что перед постановкой реакции сыворотку крови пациента необходимо прогреть при температуре 56⁰С в течение 30 минут для инактивации собственного комплемента. Пробирку с рабочей системой помещают в термостат при 37⁰С на 30 минут для инкубации. Во вторую пробирку вносят «индикаторную систему», которая включает в себя эритроциты барана (ЭБ) и гемолитическую сыворотку (содержит АТ против ЭБ). После окончания инкубации содержимого первой пробирки в неё переносят содержимое второй и вновь инкубируют в термостате при 37⁰С в течение 30 минут. Учёт реакции визуальный по обнаружению гемолиза эритроцитов. В случае положительной реакции (искомые АТ в сыворотке крови пациента подошли к АГ диагностикума) к комплексу «АГ-АТ» присоединится С1- компонент системы комплемента (свяжется с ним) и ЭБ остаются интактными. Если в сыворотке крови пациента отсутствуют искомые АТ (отрицательная реакция), то комплекс

«АГ-АТ» не формируется и С1- компонент, оставшись свободным, связывается с комплексом «ЭБ-гемолитическая сыворотка», активируется комплементарный каскад и ЭБ подвергаются гемолизу (феномен «лаковой крови»).

 

 

57. Серологическая диагностика инфекционных заболеваний. Определение. Серологические реакции, применяемые для серодиагностики, их компоненты и учет.

Серологические исследования включают в себя различные серологические реакции:

• Реакция агглютинации.

• Реакция преципитации.

• Реакция связывания комплемента.

• Реакция с использованием меченых антител или антигенов или РИФ.

 

Реакция агглютинации – это специфическая серологическая реакция взаимодействия АГ и АТ, протекающая в присутствии электролита, с образованием комплексов (в виде хлопьев или зёрен), выпадающих в осадок. В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Компоненты:

1. Раститрованная сыворотка больного (в ней ищут АТ к определенному АГ)

2. Бактериальный диагностикум

Учет визуальный:

- при + реакции – белые хлопья

- при - реакции – отсутствие хлопьев

 

 

Реакция преципитации (кольцепрепитации) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.

Компоненты:

1. Исследуемый материал (в нем ищут растворимый АГ)

2. Преципитирующая сыворотка

Учет визуальный:

- при + реакции на границе двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата;

- при – реакции кольца нет

 

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело.

Компоненты:

1. Сыворотка больного (в ней ищут АТ к определенному АГ)

2. Диагностикум

3. Комплемент

Для учета реакции добавляют индикаторную систему, состоящую из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки.

Учет визуальный:

- при + реакции – осадок из эритроцитов

- при – реакции – гемолиз («лаковая кровь»)

 

Реакция с использованием меченых антител или антигенов, или Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) заключается в использовании АТ или (реже) АГ, меченных молекулами флуорохрома (флуоресцирующего красителя). В качестве флуорохромов чаще всего используют флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) – краситель зелёного цвета или родамин – красно-оранжевого. Меченые АТ связываются с искомыми АГ и заставляют их светиться при облучении лазером или ультрафиолетовыми лучами, что позволяет зарегистрировать результат реакции. По способам постановки выделяют прямую и непрямую РИФ.

Компоненты:

1. Исследуемый материал (в нем ищут АГ)

2. Люминесцирующая сыворотка (АТ к искомому АГ, меченные ФИТЦ)

Учет с помощью люминесцирующего микроскопа: при «+» реакции наблюдается специфическое (чаще - зеленое) свечение.

 

58. Методы иммунодиагностики инфекционных заболеваний: сероиндикация, сероидентификация, серодиагностика.

В основе иммунодиагностики инфекционных заболеваний лежит применение серологических реаций.

Серологическая реакция- это специфические реакции обнаружения неизвестного АГ или АТ по второму известному реагенту in vitro с целью диагностики различных заболеваний, в том числе инфекционных.

Иммунодиагностика - использование иммунологических методов для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний.

1. Сероиндикация – обнаружение возбудителя в исследуемом материале, без выделения чистой культуры, с помощью диагностических сывороток. Применяется в экспресс диагностике наряду с несерологическими реакциями (ПЦР, ДНК-зондирование, РНТФ).
Реакции сероиндекации:
-РПГА
-РЛА
-реакция коаглютинации
-РП
-РИФ
-ИФА

2. Сероидентификация – обнаружение (идентификация) возбудителя в чистой культуре с помощью диагностических сывороток. Применяется в III этапе бактериологического метода для идентификации чистой культуры по антигенным свойствам.
Реакции сероидентификации:
-РА
-РП
-РЛА

3. Серодиагностика – обнаружение неизвестных антител в сыворотке крови больного с помощью диагностикумов. Самостоятельный метод диагностики инфекционных заболеваний – серологический.

 

 

59. Антитоксины. Применение антитоксических сывороток в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний.

Антитоксины – антитела, образующиеся в организме под воздействием токсинов бактериального, растительного, животного происхождения, способные нейтрализовать их повреждающие свойства. Представляют собой иммуноглобулины класса G. Антитоксины – действующее начало антитоксинных сывороток, которые получают, иммунизируя животных обезвреженными токсинами (токсоидами) либо малыми дозами нативных токсинов. Антитоксины нейтрализуют токсины, которые еще не связались клетками организма.

Антитоксические сыворотки – иммунопрепараты, изготовляемые из крови иммунных людей и животных и применяемые для лечения пассивной иммунопрофилактики токсинемических инфекций (дифтерии, столбняка, ботулизма, некоторых форм стафилококковой инфекции и др.). Лечебное и профилактическое действие антитоксической сыворотки основано на том, что содержащиеся в них антитоксины создают пассивный иммунитет, который защищает организм от токсического влияния токсинов с момента введения до 30 - 40-го дня после введения. Антитоксические сыворотки не оказывают прямого ингибирующего действия на микробы, продуцирующие токсины, и их эндотоксины. Силу Антитоксических сывороток измеряют в международных ед. (ME) или АЕ, соответствующих минимальному количеству сыворотки, нейтрализующему стандартную ед. того или иного токсина.

 

60. Реакция агглютинации. Цели ее использования в иммунодиагностике.

Реакция агглютинации – это специфическая серологическая реакция взаимодействия АГ и АТ, протекающая в присутствии электролита, с образованием комплексов (в виде хлопьев или зёрен), выпадающих в осадок.

РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови больных – (при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля);

2) определения возбудителя, выделенного от больного;

3) определения групп крови с использованием моноклональных антител

Условия постановки РА:

· АГ должен быть корпускулярным;

· АТ должны быть полными;

· В среде, где проводится реакция, должен быть электролит (0,9% - ный р-р NaCl).

Фазы РА

1. Специфическая (невидимая) - не видна невооруженным глазом и состоит в специфическом взаимодействии АТ с АГ дете