Доказательства существования «ДНК ВИЧ»

6.2.1 половину этой культуры инфицировали LAV, как описано (1), а затем разделили на две субкультуры: одну культивировали в среде без фактора роста Т-клеток (TCGF: интерлейкин-2), а другую - в среде, содержащей TCGF. Как и ожидалось, культура, питавшаяся TCGF, ​​продуцировала LAV, что определялось по пику активности RT, возникающему между 12-м днем ​​(6-й день после заражения LAV) и 21-м днем ​​в супернатанте. Напротив, клетки, культивированные в отсутствие TCGF, ​​не давали какой-либо обнаруживаемой RT... На 19 день, во время снижения продукции LAV, субкультура клеток, получавших TCGF, ​​получала свежие Т-клетки от того же донора: эти Т-клетки были активированы фитогемагглютинином (ФГА) в течение 3 дней... Шесть дней спустя (25 день) появился новый пик ОТ, но, в отличие от первого заражения, он не был временным... Во время вторая инфекция LAV, большие круглые клетки, трансформированные EBV, можно было легко увидеть в этой культуре, а также в контрольной культуре, не инфицированной LAV, что указывает на то, что иммортализация В-клеток EBV уже произошла. Иммортализованная линия В-клеток была названа RF8». (29) [Ссылка 1, на которую ссылается Монтанье, - это статья 1983 года, в которой Монтанье и др. Описали первую«изоляцию»ВИЧ (см. 5)]. Во втором исследовании 200 мл супернатанта от «ВИЧ-инфицированных» клеток FR8 объединяли в градиенты сахарозы, «фракции, содержащие вирус, объединяли» и центрифугировали. (Не указано, как они определяли существование «вируса», в какой полосе (ах) (фракция) (s)) был обнаружен "вирус", сколько полос, если таковые были обнаружены, содержали частицы, или почему полос было больше, чем одна (1. 16 г / мл), содержащий «вирус»). Осадок инкубировали с несколькими веществами, dATP, dGTP, dTPP, dCTP, включая 32dCTP и олиго (dT) праймер. Из полученных таким образом кДНК были дополнительно охарактеризованы три клона pLAV13, 75 и 82, несущие вставки размером 2,5, 0,6 и 0,8 килобаз (т.п.н.), соответственно. Все три вставки имеют общий паттерн рестрикции на одном конце, что указывает на общий сайт прайминга». Общий фрагмент HindIII-PstI из 50 пар (п.о.) был секвенирован и показал, что он содержит участок олиго (dA), предшествующий клонируемому хвосту dC. Таким образом, клоны являются копиями 3'-конца поли (А) РНК. Специфичность pLAV13 определялась в серии экспериментов по гидридизации фильтров с использованием ник-транслируемой вставки pLAV13 в качестве зонда». Во-первых,«с использованием адаптированной методики спот-блоттинга». они тестировали осадок, полученный из супернатанта "инфицированных LAV" нормальных лимфоцитов и клеток СЕМ, а также неинфицированных лимфоцитов. «Инфицированные» гранулы были положительными, а неинфицированные - отрицательными. «Во-вторых, зонд обнаружил ДНК в саузерн-блотах LAV-инфицированных Т-лимфоцитов и клеток CEM. Не было обнаружено гибридизации ДНК из неинфицированных лимфоцитов или из нормальной печени». Никаких подробностей относительно метода, использованного для создания «инфекции», не приводится, но, похоже, нормальные клетки и клетки CEM культивировали с супернатантом от клеток FR8, то есть с тем же супернатантом, который они использовали для получения зонда! Они пришли к выводу: «Вместе эти данные показывают, что ДНК LAV pLAV13 экзогенна по отношению к геному человека и обнаруживает как РНК, так и интегрированные формы ДНК, происходит из LAV-инфицированных клеток. Таким образом, pLAV13 специфичен для LAV»(91).

6.2.2 В мае 1984 года Галло и его коллеги опубликовали четыре статьи. Чтобы «изолировать» ВИЧ, они использовали линию лейкемических клеток, которую назвали HT. Невозможно узнать, из каких тканей больных СПИДом была выращена эта клеточная линия. Читая статьи за май 1984 года, создается впечатление, что линия клеток HT была культивирована с концентрированными (супернатантными) жидкостями, происходящими от отдельных пациентов со СПИДом, стимулированных культурами Т-клеток. Впоследствии исследование Gallo показало, что клеточная линия HT была культивирована с концентрированными жидкостями, первоначально собранными из отдельных культур трех пациентов и, в конечном итоге, из отдельных культур десяти пациентов. (92) Исследование Gallo показало, что эта процедура является «сомнительной научной строгостью»., Один ученый назвал эту процедуру «действительно безумной». (93) В 1985 г. Галло и его коллеги писали: «Клеточная линия H9 / HTLV-IIIB была получена из линии Т-клеток человека HT после совместного культивирования с Т-лимфоцитами, полученными от нескольких пациентов со СПИДом, и содержит множество различных форм HTLV-III» (94) Обнаружение обратной транскрипции A (n).dT15 в супернатанте считалось доказательством того, что клетки HT были инфицированы ретровирусом, ВИЧ, происходящим из тканей пациентов. Клон H9 клеточной линии HT был получен «с использованием облученной крови здорового донора в качестве питателя». (21) Клетки H9 культивировали с супернатантом от «ВИЧ» инфицированных HT-клеток. Супернатант H9 имел полосы градиента плотности сахарозы, а материал, который имел полосы, составлял 1,16 г / мл, что, без доказательств, На рисунке 1 показано, что препараты кДНК из HTLV-IIIB и HTLV-IIIZ давали идентичные паттерны, определяя виды размером около 9,0, 4,2 и 2,0 т.п.н. Эти полосы аналогичны по размеру с полосами, соответствующими размеру генома матричной РНК (мРНК) и сплайсированные мРНК последовательностей env и pX, которые ранее наблюдались в клетках, инфицированных HTLV-I, что согласуется с ожидаемым родством этих вирусов. Более того, полосы вирусной мРНК HTLV-II-инфицированных клеток были обнаружены с помощью зонда кДНК HTLV-III, и снова размеры мРНК были такими же, как у HTLV-I»! (56) Эти полосы аналогичны по размеру полосам, соответствующим размеру генома матричной РНК (мРНК) и сплайсированным мРНК последовательностей env и pX, ранее наблюдаемых в клетках, инфицированных HTLV-I, что согласуется с ожидаемым родством этих вирусов. Более того, полосы вирусной мРНК HTLV-II-инфицированных клеток были обнаружены с помощью зонда кДНК HTLV-III, и снова размеры мРНК были такими же, как у HTLV-I»! (56) Эти полосы аналогичны по размеру полосам, соответствующим размеру генома матричной РНК (мРНК) и сплайсированным мРНК последовательностей env и pX, ранее наблюдаемых в клетках, инфицированных HTLV-I, что согласуется с ожидаемым родством этих вирусов. Более того, полосы вирусной мРНК HTLV-II-инфицированных клеток были обнаружены с помощью зонда кДНК HTLV-III, и снова размеры мРНК были такими же, как у HTLV-I»! (56)

В другом исследовании, проведенном Галло и его коллегами, экстрахромосомная ДНК «инфицированных» клеток H9 была извлечена и «проанализирована на содержание неинтегрированной вирусной ДНК» с использованием кДНК, меченной 32P, в качестве вирусного зонда. «Неинтегрированная линейная вирусная ДНК была впервые обнаружена через 10 часов [«заражения»] и также присутствовала в последующие моменты времени. На рисунке 1 показан Саузерн-блот 15-часовой выборки. Полоса ~ 10 килобаз (т.п.н.) в непереваренная ДНК представляет собой линейную форму неинтегрированного HTLV-III». (95) В еще одном исследовании Галло и его коллеги сообщили, что«Поскольку было обнаружено, что провирус HTLV-III не имеет сайтов рестрикции Xba I, геномная библиотека была создана с помощью с использованием ДНК H9 / HTLV-III, расщепленной Xba I, и это было проверено с помощью зонда кДНК HTLV-III для получения молекулярных клонов полноразмерного интегрированного провируса с фланкирующими клеточными последовательностями. Четырнадцать таких клонов были получены из обогащенной библиотеки из 106 рекомбинантных фагов, и два из них были очищены от бляшек и охарактеризованы. На рис. 1 показаны рестрикционные карты этих двух клонов, обозначенных ^ HXB-2 и ^ HXB-3. Общая длина провируса HTLV-III составляет примерно 10 килобаз... Чтобы определить, содержит ли геном HTLV-III последовательности, гомологичные нормальной ДНК человека, вирусная вставка ^ XB-2... была выделена, ник-транслирована и использована для исследования HTLV-III-инфицированной и неинфицированной клеточной ДНК. В стандартных условиях гибридизации... этот зонд гибридизуется с ДНК клеток H9 / HTLV-III, а также других клеток, инфицированных HTLV-III, но не ДНК из неинфицированных клеток H9, неинфицированных клеток HT (родительская линия, из которой был клонирован H9) или нормальных тканей человека (данные не показаны). Это открытие согласуется с результатами других экспериментов, в которых неинтегрированная (репликативная промежуточная) форма HTLV-III использовалась в качестве зонда, и демонстрирует, что HTLV-III является экзогенным ретровирусом, лишенным последовательностей нуклеиновых кислот, полученных из ДНК человека». (96)

6.2.3 В 1984 году Леви и его коллеги культивировали PBMC пациента, страдающего саркомой Капоши, с помощью IL-2, полибрена и PHA. Супернатант тестировали на ОТ, клетки для реакции с сывороткой из BRU пациента Института Пастера и «некоторые культуры исследовали на наличие вируса с помощью электронной микроскопии». Положительный результат «любого из этих тестов» считался доказательством изоляции вируса. Супернатант одной из этих культур «инокулировали в свежие человеческие PMC, стимулированные за 3 дня до этого фитогемагглютинином». В течение 6 дней супернатант этой культуры имел высокую активность RT, и было сказано, что он представляет собой «вирусный изолят ARV-2». (97) Клеточную линию HUT78 культивировали с «ARV-2». В HUT78 " непереваренная ДНК из инфицированных клеток содержала вид размером 5,5 т.п.н., слабый вид размером 6 т.п.н. и широкую полосу на границе исключения геля (> 15 т.п.н.). Мы предполагаем, что виды ДНК 5,5 т.п.н. и 6 т.п.н. представляют собой неинтегрированную вирусную ДНК в кольцевой конфигурации, содержащей соответственно один и два длинных концевых повтора (LTR); верхняя широкая полоса (> 15 т.п.н.) представляет провирус, интегрированный в ДНК клетки-хозяина». В дополнительном эксперименте«цельноклеточная ДНК из клеток, инфицированных ARV-2, была частично переварена с помощью ECORI; ДНК клеток размером 9-15 т.п.н. клонировали в вектор бактериофага EMBL-4 ^, и рекомбинантный фаг идентифицировали с помощью вирус-специфичного кДНК-зонда». Среди полученных рекомбинантных фагов были ^ -9В и ^ -7А, каждый из которых имел размер 9,5 т.п.н.. (98) слабый вид на 6 КБ и широкая полоса на границе исключения геля (> 15 КБ). Мы предполагаем, что виды ДНК размером 5,5 т.п.н. и 6 т.п.н. представляют собой неинтегрированную вирусную ДНК в кольцевой конфигурации, содержащей соответственно один и два длинных концевых повтора (LTR); верхняя широкая полоса (> 15 т.п.н.) представляет провирус, интегрированный в ДНК клетки-хозяина». В дополнительном эксперименте«цельноклеточная ДНК из клеток, инфицированных ARV-2, была частично переварена с помощью ECORI; ДНК клеток размером 9-15 т.п.н. клонировали в вектор бактериофага EMBL-4 ^, и рекомбинантный фаг идентифицировали с помощью вирус-специфичного кДНК-зонда». Среди полученных рекомбинантных фагов были ^ -9В и ^ -7А, каждый из которых имел размер 9,5 т.п.н.. (98) слабый вид на 6 КБ и широкая полоса на границе исключения геля (> 15 КБ). Мы предполагаем, что виды ДНК 5,5 т.п.н. и 6 т.п.н. представляют собой неинтегрированную вирусную ДНК в кольцевой конфигурации, содержащей соответственно один и два длинных концевых повтора (LTR); верхняя широкая полоса (> 15 т.п.н.) представляет провирус, интегрированный в ДНК клетки-хозяина». В дополнительном эксперименте«цельноклеточная ДНК из клеток, инфицированных ARV-2, была частично переварена с помощью ECORI; ДНК клеток размером 9-15 т.п.н. клонировали в вектор бактериофага EMBL-4 ^, и рекомбинантный фаг идентифицировали с помощью вирус-специфичного кДНК-зонда». Среди полученных рекомбинантных фагов были ^ -9В и ^ -7А, каждый из которых имел размер 9,5 т.п.н.. (98) 5 т.п.н. и 6 т.п.н. представляют собой неинтегрированную вирусную ДНК в кольцевой конфигурации, содержащей соответственно один и два длинных концевых повтора (LTR); верхняя широкая полоса (> 15 т.п.н.) представляет провирус, интегрированный в ДНК клетки-хозяина». В дополнительном эксперименте«цельноклеточная ДНК из клеток, инфицированных ARV-2, была частично переварена с помощью ECORI; ДНК клеток размером 9-15 т.п.н. клонировали в вектор бактериофага EMBL-4 ^, и рекомбинантный фаг идентифицировали с помощью вирус-специфичного кДНК-зонда». Среди полученных рекомбинантных фагов были ^ -9В и ^ -7А, каждый из которых имел размер 9,5 т.п.н.. (98) 5 т.п.н. и 6 т.п.н. представляют собой неинтегрированную вирусную ДНК в кольцевой конфигурации, содержащей соответственно один и два длинных концевых повтора (LTR); верхняя широкая полоса (> 15 т.п.н.) представляет провирус, интегрированный в ДНК клетки-хозяина». В дополнительном эксперименте«цельноклеточная ДНК из клеток, инфицированных ARV-2, была частично переварена с помощью ECORI; ДНК клеток размером 9-15 т.п.н. клонировали в вектор бактериофага EMBL-4 ^, и рекомбинантный фаг идентифицировали с помощью вирус-специфичного кДНК-зонда». Среди полученных рекомбинантных фагов были ^ -9В и ^ -7А, каждый из которых имел размер 9,5 т.п.н.. (98) цельноклеточная ДНК из клеток, инфицированных АРВ-2, была частично переварена с помощью ECORI; ДНК клеток размером 9-15 т.п.н. клонировали в вектор бактериофага EMBL-4 ^, и рекомбинантный фаг идентифицировали с помощью вирус-специфичного кДНК-зонда». Среди полученных рекомбинантных фагов были ^ -9В и ^ -7А, каждый из которых имел размер 9,5 т.п.н.. (98) цельноклеточная ДНК из клеток, инфицированных АРВ-2, была частично переварена с помощью ECORI; ДНК клеток размером 9-15 т.п.н. клонировали в вектор бактериофага EMBL-4 ^, и рекомбинантный фаг идентифицировали с помощью вирус-специфичного кДНК-зонда». Среди полученных рекомбинантных фагов были ^ -9В и ^ -7А, каждый из которых имел размер 9,5 т.п.н.. (98)

РЕЗЮМЕ И ОБСУЖДЕНИЕ

Очевидно, что хотя Монтанье, Галло и Леви и их соответствующие коллеги ссылаются на очистку или выделение вирионов или вирусных частиц, ни одна из этих групп не представила доказательств выделения ретровирусных частиц или даже выделения вирусоподобных частиц, первых и абсолютно необходимый шаг в доказательстве существования ретровирусного генома. (На момент написания нет ни одной другой группы исследователей ВИЧ / СПИДа). Нахождение некоторой РНК с полосами 1,16 г / мл, выбор из нее фракции, обогащенной поли (A), или фрагмента заданной длины, даже если всегда обнаруживается, что они имеют одинаковую длину и последовательность, и обозначение его как HTLV-III, LAV, ARV не являются таким доказательством. Следует подчеркнуть, что даже если РНК включена в частицу, которая в градиенте плотности сахарозы составляет 1,16 г / мл, это еще не доказательство того, что это ретровирусная РНК. По словам Джона Коффина, одного из самых известных экспертов по ретровирусному геному, существуют частицы «с полным набором вирусных белков, но частицы содержат набор клеточных РНК и только около 1% геномной РНК... совокупность частиц. не требует генома... в его отсутствие могут быть заменены другие молекулы РНК». (83) Важно отметить, что, хотя все группы, Монтанье, Галло и Леви, относятся к материалу из культуральных супернатантов, которые в градиентах плотности сахарозы полосы при 1,16 г / мл в качестве вирусных частиц, вирионов и для РНК и белков с такой плотностью, как «связанные с частицами» РНК или белки, ни одна из групп не представила доказательств существования при этой плотности каких-либо частиц, подобный ретровирусу или иначе, чистый (изолированный) или другой. Вместо этого эти исследователи культивировали лимфоциты больных СПИДом и стимулировали (активировали) их с помощью самых разных агентов. Обратная транскрипция A (n).dT15 в супернатанте культуры считалась доказательством инфекции ретровирусом или даже доказательством изоляции. Супернатанты этих культур вводили в культуры лейкемических или трансформированных клеточных линий. С супернатантами от этих культур они выполнили два типа экспериментов: (а) Супернатанты были разбиты на полосы градиентов плотности сахарозы. На полосе 1,16 г / мл (а иногда и на другой полосе (ах), по крайней мере, в групповых экспериментах Монтанье, это не ясно), они обнаружили фрагменты РНК определенной длины (хотя не было двух одинаковых длин) или богат аденином, (поли (A) богатые фрагменты), и назвали их «РНК ВИЧ», «геном ВИЧ». Используя праймер (dT), «РНК ВИЧ» транскрибировали в комплементарную ДНК (кДНК); (b) Супернатанты вводили в другой набор трансформированных и лейкемических клеточных линий, а также в стимулированные культуры нормальных Т-клеток. ДНК из этих клеток, а также ДНК из культур, к которым не добавляли супернатант, гибридизовали с использованием зондов из кДНК. Положительные результаты были получены только с ДНК из клеток, к которым были добавлены супернатанты. Это свидетельство было истолковано как доказательство того, что «ДНК ВИЧ», ретровирус, произошла от пациентов со СПИДом и что эти пациенты получили ее извне, то есть ретровирус был экзогенным. был транскрибирован в комплементарную ДНК (кДНК); (b) Супернатанты вводили в другой набор трансформированных и лейкемических клеточных линий, а также в стимулированные культуры нормальных Т-клеток. ДНК из этих клеток, а также ДНК из культур, к которым не добавляли супернатант, гибридизовали с использованием зондов из кДНК. Положительные результаты были получены только с ДНК из клеток, к которым были добавлены супернатанты. Это свидетельство было истолковано как доказательство того, что «ДНК ВИЧ», ретровирус, произошла от пациентов со СПИДом и что эти пациенты получили ее извне, то есть ретровирус был экзогенным. был транскрибирован в комплементарную ДНК (кДНК); (b) Супернатанты вводили в другой набор трансформированных и лейкемических клеточных линий, а также в стимулированные культуры нормальных Т-клеток. ДНК из этих клеток, а также ДНК из культур, к которым не добавляли супернатант, гибридизовали с использованием зондов из кДНК. Положительные результаты были получены только с ДНК из клеток, к которым были добавлены супернатанты. Это свидетельство было истолковано как доказательство того, что «ДНК ВИЧ», ретровирус, произошла от пациентов со СПИДом и что эти пациенты получили ее извне, то есть ретровирус был экзогенным. (b) Супернатанты вводили в другой набор трансформированных и лейкемических клеточных линий, а также в стимулированные культуры нормальных Т-клеток. ДНК из этих клеток, а также ДНК из культур, к которым не добавляли супернатант, гибридизовали с использованием зондов из кДНК. Положительные результаты были получены только с ДНК из клеток, к которым были добавлены супернатанты. Это свидетельство было истолковано как доказательство того, что «ДНК ВИЧ», ретровирус, произошла от пациентов со СПИДом и что эти пациенты получили ее извне, то есть ретровирус был экзогенным. (b) Супернатанты вводили в другой набор трансформированных и лейкемических клеточных линий, а также в стимулированные культуры нормальных Т-клеток. ДНК из этих клеток, а также ДНК из культур, к которым не добавляли супернатант, гибридизовали с использованием зондов из кДНК. Положительные результаты были получены только с ДНК из клеток, к которым были добавлены супернатанты. Это свидетельство было истолковано как доказательство того, что «ДНК ВИЧ», ретровирус, произошла от пациентов со СПИДом и что эти пациенты получили ее извне, то есть ретровирус был экзогенным. Положительные результаты были получены только с ДНК из клеток, к которым были добавлены супернатанты. Это свидетельство было истолковано как доказательство того, что «ДНК ВИЧ», ретровирус, произошла от пациентов со СПИДом и что эти пациенты получили ее извне, то есть ретровирус был экзогенным. Положительные результаты были получены только с ДНК из клеток, к которым были добавлены супернатанты. Это свидетельство было истолковано как доказательство того, что «ДНК ВИЧ», ретровирус, произошла от пациентов со СПИДом и что эти пациенты получили ее извне, то есть ретровирус был экзогенным.

С этими экспериментами и их интерпретацией связано много проблем. Среди множества вопросов, которые поднимает их вывод, наиболее очевидны следующие: 1. ВИЧ считается ретровирусом, а ретровирусы - это частицы, содержащие, среди прочего, РНК. Как тогда можно утверждать, что РНК, которая имеет полосу 1,16 г / мл, «РНК ВИЧ», является геномом ретровируса без доказательства того, что она является составной частью частицы, вирусной или невирусной, которая имеет полосы с такой плотностью?? 2. RT неспецифична для ретровируса, и фактически A (n).dT15 может быть подвергнут обратной транскрипции всеми клеточными ДНК-полимеразами à, á и y. Можно ли тогда рассматривать обратную транскрипцию A (n).dT15 как доказательство выделения ВИЧ или даже обнаружения ретровируса? Даже если процесс обратной транскрипции специфичен для ретровирусов, может ли обнаружение процесса когда-либо считаться доказательством изоляции объекта, в данном случае ретровирусных частиц? 3. Супернатанты клеточных культур будут содержать как ДНК, так и РНК, включая некоторые из них, заключенные в клеточный дебрис (фрагменты), особенно если жизнеспособность клеток не является стопроцентной, как в случае культур, используемых тремя группами. РНК могут включать информационную РНК (которая богата аденином), а также высокомолекулярную гетерогенную нуклеиновую РНК. Эти РНК, помимо высокой молекулярной массы и неоднородности по размеру, также содержат поли (А) с поли (А), присоединенным к 3'-концу молекулы, и могут быть устойчивыми к РНКазе. Актиномицин подавляет его синтез, а также мешает его правильной переработке и распаду. (99) Из вирусологии животных также известно, что неретровирусные РНК и ДНК также имеют полосы 1,16 г / мл. (100) Как тогда можно утверждать, что только потому, что РНК имеет полосу 1,16 г / мл и богата аденином или имеет определенную длину, это «РНК ВИЧ»? Если эта РНК является «РНК ВИЧ», тогда каковы другие РНК и ДНК, которые также образуют полосы с этой конкретной плотностью? Если последние являются клеточными, почему не поли (А) РНК? 4. По определению, ретровирусы - это инфекционные частицы, содержащие только РНК. Когда они попадают в клетку, РНК обратно транскрибируется в ДНК, которая затем интегрируется в клеточную ДНК как провирус, что означает, что «ДНК ВИЧ» будет присутствовать только в клетке и больше нигде. Тем не менее, многие эксперты по ВИЧ, включая Галло, показали, что оба супернатанта «инфицированы» культуры клеток и «частицы ВИЧ», то есть материал с полосами 1,16 г / мл, содержит «ДНК ВИЧ», которая «может непосредственно интегрироваться в хромосомную ДНК хозяина». (101-103) Возникает вопрос: «ДНК ВИЧ» - результат обратной транскрипции «РНК ВИЧ» или наоборот? 5. Считается, что РНК ВИЧ локализована в конденсированном ядре, окруженном «липидно-двухслойной оболочкой, происходящей из клеточной мембраны клетки-хозяина, усеянной кодируемым вирусом gp120 и миристилированным белком, p17. Так называемое ядро- связь оболочки (CEL) прикрепляет ядро ​​к оболочке»(103). Один из наиболее известных фактов в биологии - то, что конденсированные ядра (хроматин) транскрипционно неактивны. Это одна из причин, по которой вирусы, в том числе ретровирусы, чтобы размножаться, они должны сначала войти в клетки, где их хроматин деконденсируется. Однако в статье, опубликованной в 1993 году Хуэй Чжаном и его коллегами, в том числе Пойэсом из Научного центра здоровья Suny в Сиракузах, штат Нью-Йорк, было написано: «Мы показали, что в отсутствие детергента большие количества устойчивой к ДНКазе вирусной ДНК могут быть синтезируется в интактных вирионах ВИЧ-1, что указывает на то, что это явление не зависит от нарушения вирусной оболочки. [не говоря уже о деконденсации хроматина]. Возникший синтез вирусной ДНК также происходил в очищенных вирионах, инкубированных при 37 ° в бесклеточных физиологических жидкостях человека. включая семенную плазму, грудное молоко и фекальные жидкости»(103). Это означает, что либо (i)«интактные вирионы ВИЧ-1» выполнять функцию, которую не может выполнять никакая другая биологическая система с очень конденсированным и защищенным хроматином, или (ii) «РНК ВИЧ», обнаруженная в супернатантах или в «очищенных вирионах», присутствует в бестелесной форме, или (iii) «РНК ВИЧ» «синтезируются de novo в культурах клеток (см. 6.3.5); 6. В настоящее время имеется достаточно доказательств того, что любая РНК или ДНК, присутствующая в супернатанте, независимо от ее происхождения, особенно когда клетки стимулируются поликатионами и окислителями, будет поглощаться клетками (см. 7.1). Как тогда можно утверждать, что положительный сигнал гибридизации в клетках, культивируемых с той же «ДНК ВИЧ», содержащей супернатант, что и супернатант, из которого произошел зонд «ДНК ВИЧ», но не в других клетках, является доказательством того, что «ДНК ВИЧ» такое геном экзогенного ретровируса? 7. Первым, абсолютно необходимым шагом в доказательстве того, что «ДНК ВИЧ» произошла из лимфоцитарных клеток больных СПИДом и лиц из группы риска, является проведение экспериментов по гибридизации с использованием ДНК их свежих, некультивируемых лимфоцитов и «ДНК ВИЧ» в качестве зонд. Трудно понять, почему ни группа Монтанье, ни группа Леви не сообщали о подобных экспериментах. Группа Галло сделала это, и результаты были отрицательными (см. 6.4.4). Как тогда можно утверждать, что «ДНК ВИЧ» - это геном экзогенного ретровируса, который произошел от больных СПИДом и лиц из группы риска? 8. Чтение основополагающего документа о выделении ВИЧ под названием «Обнаружение, выделение и непрерывное производство цитопатических ретровирусов (HTLV-III) у пациентов со СПИДом и пре-СПИДом» Создается впечатление, что линия клеток лейкемии HT, которую использовали Галло, Попович и их коллеги, была новой линией клеток, созданной ими. Исследование Gallo показало, что клеточная линия HT (H9) такая же, как и использованная группой Леви, HUT78, лейкемическая клеточная линия, созданная в другой лаборатории. Однако многочисленные доказательства существования эндогенных ретровирусов человека были получены в основном в результате экспериментов с лейкемическими и трансформированными клетками. Существуют доказательства того, что как H9, так и EBV-трансформированные B-лимфоциты выделяют ретровирусоподобные частицы, даже если они не «инфицированы ВИЧ». (104) Кроме того, клеточная линия HUT78 (H9) была получена от пациента с «злокачественными новообразованиями зрелых клеток T4»., заболевание, которое, согласно Галло, вызывается экзогенным ретровирусом HTLV-I. Действительно, еще в 1983 году он утверждал, что продемонстрировал, что линия клеток HT (H9) содержит провирусные последовательности HTLV. (105) По мнению некоторых американских исследователей, нормальные B-лимфоциты периферической крови человека, трансформированные EBV, содержат транскрипты, связанные с HTLV-I.. (106) Поскольку все ретровирусные частицы по определению имеют полосу 1,16 г / мл, если предположить, что все группы имели ретровирус этой плотности, как можно утверждать, что ретровирус, происходящий из HUT78 и трансформированных EBV B-лимфоцитов, является новый ретровирус ВИЧ, а не тот, который уже был? Можно ли утверждать, что «РНК ВИЧ» и, следовательно, пробы и праймеры, происходящие из нее, являются РНК, зондами и праймерами уникального экзогенного ретровирусного генома? 9. Биологическая догма гласит, что ДНК синтезируется на матрице ДНК, РНК - на матрице ДНК, и белки на матрице РНК. Другими словами, единственный способ для клетки приобрести новые сущности нуклеиновой кислоты - это ввести их извне, экзогенно либо из другого типа клеток, инфекционного агента или синтетической нуклеиновой кислоты. Если биологическая догма верна, тогда «РНК ВИЧ», будь то клеточная или вирусная молекулярная единица, должна происходить либо из лимфоцитов пациентов, либо из трансформированных и лейкемических клеточных линий. Однако, когда в качестве зонда использовалась «кДНК ВИЧ», ни одна из групп не сообщила о положительных результатах гибридизации какой-либо из клеток, даже лимфоцитов больных СПИДом. Тогда возникает вопрос, существует ли уникальная молекулярная сущность, «ДНК ВИЧ»? Что это значит и откуда оно взялось? единственный способ для клетки приобрести новые сущности нуклеиновой кислоты - это ввести их извне, экзогенно либо из другого типа клеток, инфекционного агента или синтетической нуклеиновой кислоты. Если биологическая догма верна, тогда «РНК ВИЧ», будь то клеточная или вирусная молекулярная единица, должна происходить либо из лимфоцитов пациентов, либо из трансформированных и лейкемических клеточных линий. Однако, когда в качестве зонда использовалась «кДНК ВИЧ», ни одна из групп не сообщила о положительных результатах гибридизации какой-либо из клеток, даже лимфоцитов больных СПИДом. Тогда возникает вопрос, существует ли уникальная молекулярная сущность, «ДНК ВИЧ»? Что это значит и откуда оно взялось? единственный способ для клетки приобрести новые сущности нуклеиновой кислоты - это ввести их извне, экзогенно либо из другого типа клеток, инфекционного агента или синтетической нуклеиновой кислоты. Если биологическая догма верна, тогда «РНК ВИЧ», будь то клеточная или вирусная молекулярная единица, должна происходить либо из лимфоцитов пациентов, либо из трансформированных и лейкемических клеточных линий. Однако, когда в качестве зонда использовалась «кДНК ВИЧ», ни одна из групп не сообщила о положительных результатах гибридизации какой-либо из клеток, даже лимфоцитов больных СПИДом. Тогда возникает вопрос, существует ли уникальная молекулярная сущность, «ДНК ВИЧ»? Что это значит и откуда оно взялось? существует? Что это значит и откуда оно взялось? существует? Что это значит и откуда оно взялось? экзогенно либо из другого типа клеток, инфекционного агента или синтетической нуклеиновой кислоты. Если биологическая догма верна, тогда «РНК ВИЧ», будь то клеточная или вирусная молекулярная единица, должна происходить либо из лимфоцитов пациентов, либо из трансформированных и лейкемических клеточных линий. Однако, когда в качестве зонда использовалась «кДНК ВИЧ», ни одна из групп не сообщила о положительных результатах гибридизации какой-либо из клеток, даже лимфоцитов больных СПИДом. Тогда возникает вопрос, существует ли уникальная молекулярная сущность, «ДНК ВИЧ»? Что это значит и откуда оно взялось? экзогенно либо из другого типа клеток, инфекционного агента или синтетической нуклеиновой кислоты. Если биологическая догма верна, тогда «РНК ВИЧ», будь то клеточная или вирусная молекулярная единица, должна происходить либо из лимфоцитов пациентов, либо из трансформированных и лейкемических клеточных линий. Однако, когда в качестве зонда использовалась «кДНК ВИЧ», ни одна из групп не сообщила о положительных результатах гибридизации какой-либо из клеток, даже лимфоцитов больных СПИДом. Тогда возникает вопрос, существует ли уникальная молекулярная сущность, «ДНК ВИЧ»? Что это значит и откуда оно взялось? должны происходить либо из лимфоцитов пациентов, либо из трансформированных и лейкемических клеточных линий. Однако, когда в качестве зонда использовалась «кДНК ВИЧ», ни одна из групп не сообщила о положительных результатах гибридизации какой-либо из клеток, даже лимфоцитов больных СПИДом. Тогда возникает вопрос, существует ли уникальная молекулярная сущность, «ДНК ВИЧ»? Что это значит и откуда оно взялось? должны происходить либо из лимфоцитов пациентов, либо из трансформированных и лейкемических клеточных линий. Однако, когда в качестве зонда использовалась «кДНК ВИЧ», ни одна из групп не сообщила о положительных результатах гибридизации какой-либо из клеток, даже лимфоцитов больных СПИДом. Тогда возникает вопрос, существует ли уникальная молекулярная сущность, «ДНК ВИЧ»? Что это значит и откуда оно взялось?

СПЕКУЛЯЦИИ НА «ДНК ВИЧ»

Если кто-то хочет порассуждать о природе и происхождении РНК (кДНК), полученной из культур, содержащих ткани пациентов со СПИДом и тех, кто находится в группе риска, и какие полосы составляют 1,16 г / мл, есть много возможностей, включая:

6.3.1. Хотя на сегодняшний день таких доказательств не существует, возможно, что участок РНК, в настоящее время называемый «РНК ВИЧ», является геномом экзогенного ретровируса, ВИЧ. Однако для того, чтобы это считалось доказанным, в дополнение к удовлетворению всех требований в 6.1 необходимо также показать, что: (i) уникальный участок РНК может быть получен только из культур конкретных людей; (ii) когда РНК (или кДНК) используется в качестве зонда для тестирования свежих некультивируемых лимфоцитов, положительный тест получают только из свежих клеток людей, которые также имеют положительную культуру; (iii) что у животных или людей ретровирус передается горизонтально (от животного к животному, от человека к человеку).

6.3.2 Геном эндогенного ретровируса, то есть участок РНК с соответствующей матрицей ДНК, присутствующий в клеточной ДНК неинфицированных животных, который передается из поколения в поколение вертикально (от родителей к потомству через линию зародышевых клеток) и который ниже определенные условия могут быть выражены и включены в ретровирусные частицы. На протяжении многих десятилетий было известно, что ДНК животных содержит последовательности, «близкие или идентичные таковым инфекционных вирусов». Однако геном человека считался исключением, и еще в 1994 году и Галло, и Фаучи придерживались мнения, что «… не существует известных эндогенных ретровирусов человека».107 Фактически, в 1970-х и 1980-х годах после заявления Галло об открытии HL23V, HTLV-I, а затем HTLV-II, и особенно после заявления Монтанье об открытии ВИЧ, значительно больший интерес вызвали ретровирусы, в результате чего стало «все более ясно, что ДНК человека, как и ДНК других позвоночных, содержит множество интегрированных ретровирусных геномов» (25, 108) и что во многих случаях гены экспрессируются, «включая транскрипты мРНК, относящиеся к полноразмерной эндогенной ретровирусной ДНК» (109, 110) с открытыми рамками считывания для белков gag, pol и env111. К 1987 году многие исследователи сообщили об экспрессии генома эндогенного ретровируса человека, HERV-K, гомологичного вирусу опухоли молочной железы мыши (MMTV). «В нескольких клеточных линиях геном HERV-K был экспрессирован как поли (А) + РНК 8,8 тыс. Оснований, которая, по-видимому, является полноразмерным транскриптом этого генома». Когда линия клеток рака груди человека T47D «выращивалась в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, экспрессия генома HERV-K была незначительной». Однако, когда клетки обрабатывали эстрадиолом, а затем прогестероном, они продуцировали «ретровирусоподобные частицы и растворимый белок, разделяющий антигенные детерминанты с продуктом гена env MMTV». (112) В подтверждение их тезиса «что эндогенная ОТ человека может опосредовать движения генов, ведущие к к лейкозу и раку», исследователи из Университета Ганемана, Филадельфия, включая Дэвида Гиллеспи, давнего сотрудника Галло,«продемонстрировали наличие фермента, подобного обратной транскриптазе, в ретровирусных частицах пациентов с эссенциальной тромбоцитемией, истинной полицитемией и хроническим миелогенным лейкозом., Впоследствии было показано, что геном человека содержит 50 копий HERV-K. HERV-K представляет собой эндогенный ретровирусный элемент класса I человека, который содержит открытые рамки считывания gag, pol и env... а также интактные участки LTR... Экспрессия геномных транскриптов РНК HERV-K размером 9 т.п.н. была обнаружена в линиях клеток человека... Нам впервые удалось показать экспрессию гена pol HERV-K в лейкоцитах крови человека. Ген HERV-K pol был экспрессирован в клетках периферической крови двух групп людей, не страдающих лейкемией. Первая группа состояла из 7 нормальных доноров, а вторая группа состояла из 3 пациентов с PV, все из которых экспрессировали ген pol HERV-K. Пять различных нуклеотидных последовательностей были получены от 7 нормальных доноров. Четыре из 5 нормальных последовательностей содержали гетерогенные открытые рамки считывания для pol, как обнаружено с помощью ОТ-ПЦР и защиты от РНКазы. В отличие от нормальных доноров, которые случайным образом экспрессируют провирусы HERV-K, анализ pol HERV-K от пациента с PV показал избирательную экспрессию ограниченного семейства родственных провирусов». (113) К 1995 году Галло признал, что человеческая клетка действительно содержит ретровирусные геномы, но он по-прежнему настаивали на том, что они дефектны: «Ретровирусы передаются либо генетически (эндогенные формы), либо как инфекционные агенты (экзогенные фо