Определение оптимальной дозы активного хлора

 

Цель работы: ознакомиться с методом определения оптимальной дозы хлора для обеззараживания природных вод.

10.1. Теоретическая часть

В природной воде среди различных микроорганизмов могут находиться и патогенные (болезнетворные). Поэтому воду открытых водоемов перед употреблением для хозяйственно-бытовых нужд необходимо обеззаразить. Обеззараживание может быть осуществлено различными методами: физическими, физико-химическими и химическими.

Процессы обеззараживания природных вод химическими методами сводятся к окислению составных частей цитоплазмы патогенных микроорганизмов различными реагентами.

Существование в природных водах аэробных патогенных микроорганизмов показывает, что окислительно-восстановительный потенциал кислорода в нейтральной среде (j = 0,82 В) недостаточен для их окисления. Поэтому для обеззараживания воды должны применяться окислители с более высоким потенциалом, который может служить критерием для выбора обеззараживающих веществ и оценки силы их воздействия. Основываясь на этом, в качестве химических реагентов могут быть предложены такие способы химического обеззараживания, как озонирование и хлорирование.

Озонирование - очень перспективный метод, но наиболее употребляемым методом обеззараживания воды является хлорирование. Оно может осуществляться различными реагентами: свободным жидким и газообразным хлором, хлорноватистой кислотой, гипохлоритами (солями хлорноватистой кислоты), белильной известью и др.

Во всех этих соединениях окислительными свойствами обладает так называемый активный хлор. Под активным хлором понимают то количество свободного молекулярного хлора, которое отвечает окислительной способности данного соединения.

Количество хлора, идущего на окисление органических и неорганических примесей, определяет величину хлорпоглощаемости воды. Дозу обеззараживающего реагента выбирают таким образом, чтобы после окисления всех примесей оставалось некоторое избыточное количество хлора - остаточный хлор. Эта доза является оптимальной и достаточной. Согласно ГОСТ на питьевую воду после 30-минутного контакта хлора с водой остаточного хлора должно быть не более 0,5 мг/л и не менее 0,3 мг/л при выходе с очистных сооружений и не менее 0,1 мг/л в наиболее отдаленных точках водозабора.

Остаточный хлор в питьевой воде при предварительном осветлении определяют через каждый час. Оптимальную дозу обеззараживающего реагента определяют пробным хлорированием.

10.2. Экспериментальная часть

10.2.1. Определение концентрации активного хлора в хлорной извести

В коническую колбу емкостью 250 мл всыпать щепотку (примерно 0,5 г) иодида калия и растворить его в 2-3 мл дистиллированной воды. Затем пипеткой ввести 25 мл исследуемого раствора хлорной извести и 5 мл серной кислоты (1:5). При этом в растворе происходит окислительно-восстановительный процесс, описываемый следующим уравнением:

Выделившийся свободный йод оттитровать 0,01 Н раствором тиосульфата натрия (Na₂S₂O₃) до слабо-желтого окрашивания. Затем добавить 1 мл раствора крахмала и титровать раствор до исчезновения синей окраски от одной капли тиосульфата натрия. При этом происходит окислительно-восстановительный процесс по следующему уравнению:

Рассчитать концентрацию активного хлора в исследуемом растворе хлорной извести по формуле, мг/мл,

где 35,5 - эквивалентная масса хлора.

 

10.2.2. Определение оптимальной дозы хлора для обеззараживания природной воды

В пять колб налить по 250 мл исследуемой воды и в каждую ввести одну из следующих доз хлора, мг/л: 0,5; 1,0; 2; 4; 9. Исходя из рассчитанной концентрации активного хлора в белильной извести, определить, какому объему ее, мл, будут соответствовать вышеприведенные количества хлора.

После 30-минутного контакта исследуемой воды с введенным хлором определить в каждой пробе концентрацию остаточного хлора, мг/л. Для этого в каждую пробу добавить щепотку йодистого калия (около 0,5 г) и по 5 мл серной кислоты (1:5).

Выделившийся йод оттитровать 0,01 Н раствором тиосульфата натрия по методике 10.2.1.

Рассчитать концентрацию остаточного хлора в каждой пробе.

По полученным данным построить график хлорпоглощаемости исследуемой воды, откладывая по оси абсцисс дозу выделенного хлора, мг/л, а по оси ординат - концентрацию остаточного хлора, мг/л. По графику определить оптимальную дозу хлора.

Вычислить показатель хлорируемости воды О_хл по формуле:

,

где Д - доза введенного хлора, соответствующая содержанию остаточного хлора 0,5 мг/л.

По результатам работы написать отчет.

 

МИКРОБИОЛОГИЯ

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА N 11

УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА И ПРИЕМЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ

 

Цели: 1.Знакомство устройством светопольного микроскопа.

      2. Приготовление препаратов фиксированных клеток.

      3. Знакомство с морфологией микроорганизмов.

Кроме мира, видимого невооруженным глазом, вокруг нас присутствует невидимый мир ничтожно малых живых существ, которые называются микроорганизмами (м/о). Изучением м/ов занимается микробиология.

М/Б - micros-малый, bios-жизнь, logos- учение. Она изучает строение, жизнедеятельность м/ов и изменения, вызываемые ими в окружающей природе. Всякое изучение начинается с морфологии.

МОРФОЛОГИЯ - структура, форма и особенности строения клеток микроорганизмов. Изучение м/о возможно только через микроскоп.

1. ЗНАКОМСТВО С УСТРОЙСТВОМ СВЕТОП. М/П.

М/П - сложный оптический прибор, оптическая часть которого смонтирована на специальный штатив.

                   колонка (2 винтовые системы) (к колонке подвижно прикреплены

Штатив                                                                            тубус и столик)

                   основание

2     винтовые системы: - макрометрический винт - позволяет быстро передвигать тубус;

- микрометрический винт- для детальной, более точной установки тубуса.

3     увеличительные системы:

1- объектив (внизу тубуса)- дает действительное изображение рассматриваемого объекта (сила увеличения- 10х, 40х, 90х).

2- окуляр - система увеличительных стекол, с помощью которых происходит увеличение изображения, даваемого объективом (находится в верхнем конце тубуса). Сила увеличения-7х, 10х, 15х раз.

3- линза конденсора (у основания м/п) - система увеличительных стекол, пройдя через которую свет фокусируется на объекте.

Объектив с увеличением 90х - иммерсионный объектив.

 

ПРАВИЛА РАБОТЫ С ИММЕРСИОННЫМ ОБЪЕКТИВОМ:

1. Устанавливаем объектив с увеличением х20.

Вращая макровинтом и глядя в окуляры, находим колонию микроорганизмов.

2. Установим объектив х90.

На сухой окрашенный препарат наносим каплю иммерсионного масла.

4. Глядя сбоку, осторожно опускают макровинтом тубус м/п до погружения объектива в масло, (следят за тем, чтобы линза не коснулась стекла).

5. Наблюдая в окуляр, макровинтом медленно поднимают тубус и фокусируют объект.

6. Зарисовать все просмотренные препараты. (название препарата на латинском языке).

2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ФИКСИРОВАННЫХ КЛЕТОК.

Подготовка препаратов фиксированных клеток.

Фиксированные окрашенные препараты м/ов рассматриваются через

иммерсионный объектив. Их приготовление включает следующие этапы:

1. Приготовление мазка.

2. Высушивание.

3. Фиксация.

4. Окраска.

1.     Пробирку с культурой. м/ов берут в левую руку и держат в горизонтальном или в наклонном положении. В правую руку берут бактериальную петлю и прокаливают ее в пламени горелки. Затем вводят в пробирку и, отобрав небольшое количество микробной массы, наносят на предметное стекло.

2.    Высушивание - при комнатной температуре на воздухе. 3.Фиксация преследует несколько целей:

а) обеспечить прикрепление клеток к стеклу;

б) сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше;

в) сделать безопасным дальнейшее обращение с мазком.

Фиксацию клеток осуществляют термической обработкой - препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени спиртовки.

4. Окрашивание - для простого окрашивания будем использовать генциановый фиолетовый. Фиксированный препарат помещают на 2 // стеклянные палочки, соединенные резиновым шлангом. Помещаем на края кюветы и заливаем красителем на 2-3 минуты.

По окончании окраски препарат промывают водой (пока вода не станет прозрачной). Препарат высушивают на воздухе.

РАССМАТРИВАЕМЫЕ ПРЕПАРАТЫ.

1. STREPTOCOCCUS LACTIS.

2. LACTOBACTERIUM ACIDOPHILUM.

3. SACCHAROMYCES.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 12

МЕТОДЫ УЧЕТА ЧИСЛЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

1. Учет численности микроорганизмов в почве методом питательных пластин в сочетании с методом последовательных разведений

Почва — наиболее благоприятная среда для развития микроорганизмов. В связи с большой гетерогенностью ее состава для учета численности в ней микроорганизмов с исследуемого участка берут среднюю почвенную пробу.

Сначала готовят суспензии (методом разведения), содержащие разные концентрации почвы в 1 мл воды. Для этого стерильное часовое стекло стерильным фарфоровым шпателем или алюминиевой чайной ложкой берут из банки или мешка навеску почвы в 1 г. Часовое стекло, шпатель, ложку фломбируют в пламени горелки или, смочив в спирте, обжигают. При взвешивании почвы часовое стекло накрывают другим стерильным часовым стеклом.

Навеску почвы, соблюдая условия асептики, переносят в колбу на 250 мл с 99 мл стерильной воды. Смесь взбалтывают 5 мин, не смачивая пробку. Стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии, содержащей 10^-2 г почвы, и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Пипетку неоднократно промывают водой в пробирке, чтобы максимально смыть клетки с ее стенок. Другой стерильной пипеткой берут из колбы еще 1 мл суспензии и помещают во вторую колбу, также содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды. Эту пипетку промывают таким же образом, как и в первом. Пробирку и вторую колбу взбалтывают 1 мин. Концентрация почвы в пробирке будет 10^-3 г, во второй колбе — 10^-4 г. Точно так же новыми стерильными пипетками переносят по 1 мл суспензии из второй колбы во вторую пробирку с 9 мл и в третью колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды и готовят новые суспензии, содержащие в 1 мл соответственно 10^-5 и 10^-6 г почвы.

Для определения численности микроорганизмов в каждом разведении методом питательных пластин можно провести глубинный или поверхностный посев. Последний - более сложный и занимает больше времени. Поэтому для подсчета численности бактерий в почве методом питательных пластин можно ограничиться глубинным посевом, а поверхностный использовать при учете численности различных физиологических групп микроорганизмов на плотных средах.

Для определения количества живых клеток, содержащихся в 1 мл суспензии каждого разведения, берут по 1 мл этих суспензий и переносят в стерильные чашки Петри, используя всякий раз новую стерильную пипетку. На крышках чашек стеклографом отмечают исследуемый вариант и разведение. Затем в чашки Петри вливают расплавленный МПА, заранее приготовленный и разлитый в пробирки на 20 мл (²/₃ объема) из расчета одна пробирка на чашку. Температура агара должна быть примерно 45 °С. Ее определяют, прикладывая пробирку с расплавленным агаром к щеке: если щеке не горячо — среду можно вылить в чашку Петри. Осторожными круговыми движениями чашки, не смачивая крышку, агар перемешивают с суспензией. Чашки с застывшим агаром переворачивают вверх дном, чтобы избежать попадания на его поверхность конденсационной влаги с крышки, и помещают в термостат при 28—30 °С.

Клетки микроорганизмов, попав в питательную среду, начинают размножаться и образуют видимые невооруженным глазом колонии. Каждая колония на чашке с питательной средой вырастает из одной колониеобразующей единицы (КОЕ), которая может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, спору, кусочек мицелия актиномицета или гриба. Через 48 ч инкубации чашки вынимают из термостата и предварительно подсчитывают число колоний. В связи с тем что существуют медленнорастущие формы бактерий, окончательный подсчет делают на 5-е сут.

Количество КОЕ в 1 г сырой почвы устанавливают, умножая число колоний в чашке на степень разведения — число, показывающее, во сколько раз в каждом конкретном случае разбавили 1 г почвы. Казалось бы, во всех вариантах посева должно получиться примерно одинаковое число КОЕ, однако Практике происходит не так.

Иногда клеток так много, что развившиеся колонии микроорганизмов сливаются, что часто наблюдается в чашках при разведении 10^-2. При высоких разведениях вырастают единичные колонии (меньше 10 на чашке), которые могут образоваться от случайно попавших клеток из воздуха при внесении в чашку почвенной суспензии или питательной среды. Учет таких чашек сделает подсчет недостоверным. Для правильного определения численности КОЕ подсчитывают только чашки, в которых колоний свыше 10 и не более 250—300 (в последнем случае при условии, если колонии очень мелкие).

При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и, чтобы дважды не учитывать одни и те же колонии, подсчитанные отмечают чернилами или тушью. Чтобы пропустить мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой. Можно использовать и специальный прибор для подсчета колоний.

Бывают случаи, когда в последнем разведении (10^-б) число колоний значительно больше 300. Такой посев желательно повторить, увеличив число разведений. Если это невозможно, подсчет выполняют, учитывая, что он дает представление о минимальной численности микроорганизмов в почве.

Метод питательных пластин легко выполним, но ряд недостатков, самый существенный из которых — отсутствие универсальной среды для развития всех микроорганизмов, обитающих в почве. Питание у разных бактерий специфично, и на каждой среде выявляется довольно узкая физиологическая группа. Так, на МПА развиваются в основном гнилостные бактерии, способные усваивать легко доступные органические формы азота. Нитрифицирующие, целлюлозоразрушающие, азотфиксирующие и другие бактерии на этой среде не развиваются. Для более полного представления о населенности делают посевы на элективные среды или используют| метод прямого подсчета микроорганизмов под микроскопом.

Второй недостаток метода питательных пластин - вероятность неполного учета клеток в образце в связи с тем, что в одном месте в агаре может застыть не одна, а несколько клеток. Образованные ими колонии сливаются, создавая впечатление одной колонии. Если такие колонии имеют неоднородную структуру, можно внести поправку при подсчете, приготовив них окрашенный препарат. Если под микроскопом обнаруживаются разные формы клеток, например кокки, палочки и сарцины, то считают, что это не одна колония, а, как в данном примере, три. Если все формы клеток одинаковые, то расценивают колонию как результат развития одной клетки (хотя в этом месте одинаковых клеток могло быть 5, 10 и более). Для сравнения количества КОЕ в разных почвах необходимо подсчитать их число в 1 г абсолютно сухой почвы. С этой целью одновременно со взятием навески почвы для приготовления разведений в отдельный бюкс (металлический или стеклянный), высушенный до постоянной массы, берут навеску (5—10 г) для определения влажности почвы. Сушат почву при 105 °С до постоянной массы. Для определения числа КОЕ в 1 г сырой почвы определяют разность между массами сырой и сухой почвы, делят ее на массу навески и умножают на 100. Затем число клеток в 1 г сырой почвы надо разделить на количество абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Пример расчета.В1г сырой почвы содержится 5600 клеток. При влажности почвы 30% это число клеток будет соответствовать 0,7 г абсолютно сухой почвы. Определяем численность клеток в 1 г абсолютно сухой почвы:

0,7 г абсолютно сухой почвы содержат 5600 клеток

1,0 г                                     »            »                                        х

Таким образом, в 1 г абсолютно сухой почвы содержится 8 тыс. живых клеток.

2. Учет численности КОЕ в воде и других жидкостях

Число микроорганизмов в воде, навозной жиже, огуречном рассоле и других жидких субстратах можно определять различными методами. Если исследование ведут, пользуясь методом питательных пластин, то сначала воду и другие исследуемые жидкости 3 мин хорошо взбалтывают. Затем берут стерильной пипеткой 1 мл жидкости и вносят ее в 99 мл стерильной водопроводной воды. Это — исходное разбавление субстрата в 100 раз. Другой стерильной пипеткой набирают 10 мл исходного разведения и вносят в 90 мл воды, взбалтывают 5 мин и далее готовят методом разведения разные концентрации исследуемой жидкости и определяют число КОЕ в 1 мл, как в пункте 1.

3. Учет численности КОЕ в воздухе

При определении числа микроорганизмов в воздухе его определенный объем пропускают через пробирку с 10 мл стерильной водопроводной воды. Для этого ее закрывают стерильной пробкой с двумя стеклянными трубками. Одну трубку, сообщающуюся с воздухом, опускают в воду до дна пробирки, а отверстие другой, соединенной с аспиратором, находится сразу под пробкой. По количеству воды (в литрах), выпущенной из аспиратора, устанавливают объем воздуха, прошедшего через стерильную воду в пробирке.

При прохождении воздуха через воду микроорганизмы остаются в воде, и их численность затем определяют после приготовления соответствующих разведений методом питательных пластин, как было описано выше. Зная объем воздуха, прошедшего через воду, делают пересчет на 1 м³ воздуха.

Для определения количества КОЕ в воздухе можно использовать и более простой, но менее точный метод Коха (осаждение клеток микроорганизмов на плотных питательных средах). Суть его сводится к следующему. Стерильные чашки Петри с питательной средой (МПА, МПЖ или кусок вареной картофелины) открывают в исследуемом помещении (или на исследуемой площади) на 5 мин. Частицы пыли с бактериями под действием силы тяжести оседают на поверхность плотной питательной среды. Через 48 ч инкубации при 28—30°С осевшие бактерии образуют на среде колонии, которые можно подсчитать. Поскольку некоторые микроорганизмы развиваются медленно, окончательно подсчитывают колонии на 5-е сут.

На площади в 100 см² за 5 мин осаждается примерно столько клеток, сколько их находится в 10 л воздуха (0,01 м³). Зная площадь чашки Петри, можно подсчитать количество клеток в 1 м³ воздуха. Для этого число колоний, выросших в чашке Петри, относят к общей площади чашки, затем пересчитывают, сколько таких колоний поместилось бы на 100 см и далее — в 1 м³ воздуха.

Пример расчета. В чашке Петри диаметром 10 см выросло 45 колоний. Площадь чашки (πr²) составит 3,14 • 5² = 78,5 (см²). Далее подсчитывают число клеток на 100 см² (равнозначных 10 л, или 0,01 м³ воздуха:

78,5 см² воздуха содержат 45 клеток

100,0 см²»                    »    х

 

Таким образом, в 0,01 м³ воздуха находится 57 клеток, а в 1 м³ их будет в 100 раз больше — 5700.

В исследуемых помещениях чашки Петри с агаром лучше размещать по 2—3. После подсчета колоний в каждой чашке выводят их среднее арифметическое значение.

Материалы и оборудование:

Часовые стекла, шпатели, ложки, почва, стерильные колбы на 250 мл со 100 мл и стерильные пробки с 9 мл водопроводной воды, стерильные пипетки Мора на 1 мл, колбы с расплавленным МПА, стерильные чашки Петри, микроскопы и все необходимое для микроскопирования.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 13

ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Формы клеток на примере представителей рода Saccharomyces, мукоровых и плесневых грибов.

 

Объектами микробиологии служат многие виды микроскопических грибов.

Грибы относятся к эукариотам. Тело гриба состоит из мицелия, или грибницы, — сплетения тонких ветвящихся нитей — гиф.

 Зигомицеты. Низшие грибы, имеют хорошо развитый ветвистый одноклеточный мицелий. Размножаются как половым путем, так и бесполым, т. е. при помощи спор.

Представитель класса — мукор (Mucor mucedo) развивается в виде войлочного белого или серого налета на продуктах растительного происхождения и навозе травоядных животных.

Мицелий мукоровых грибов пронизывает субстрат и частично стелется по его поверхности. Вверх от грибницы отходят особые воздушные гифы— спорангиеносцы, вздувающиеся на концах. Вздутия представляют собой спорангии, в дальнейшем они отделяются от спорангиеносцев перегородкой. В спорангиях бесполым путем образуются многочисленные спорангиоспоры — эндоспоры (от греч. endon — внутри).

Перегородка, отделяющая спорангий от спорангиеносца, расположена куполообразно, поэтому верхняя часть спорангиеносца оказывается внутри спорангия. Этот участок спорангиеносца называется колонкой и у разных видов мукоровых грибов имеет различную форму (грушевидную, шаровидную, цилиндрическую).

Для просмотра мукоровых грибов следует осторожно взять препаровальной иглой небольшое количество мицелия и другой препаровальной иглой снять его на сухое предметно стекло. Препарат сначала рассматривают без покровного стекла при малом увеличении микроскопа. Видны спорангиеносцы, и круглые темные шарики на их концах — спорангии. Обычно они покрыты тонкими шипами из кристаллов оксалата кальция. Затем на поверхность препарата наносят каплю воды, накрывают его покровным стеклом. Оболочка спорангия при этом разрушается, и споры выпадают. Препарат рассматривают последовательно при малом и большом увеличениях (без иммерсии).

Представители рода Мисог могут быть выделены из почвы при посеве пылевидных ее частиц на поверхность сусло-агара в чашках Петри или из свежего конского навоза, помещенного на 3—4 дня под стеклянный колпак на тарелку с влажной фильтровальной бумагой или сырым песком.

Аскомицеты, или сумчатые грибы. Высшие грибы с многоклеточным или членистым мицелием, образующие споры в сумках — асках. Они включают представителей эуаскомицетов (истинных аскомицетов), у которых сумки со спорами формируются в результате полового процесса на поверхности или внутри плодовых тел, образуемых сплетением гиф мицелия (возможно бесполое размножение экзогенно возникающими спорами — конидиями), и гемиаскомицетов, у которых плодовые тела отсутствуют. К гемиаскомицетам относят большинство дрожжей, рассматриваемых отдельно.

Эуаскомицеты включают два важнейших рода почвенных грибов — Penicillium и Aspergillus, которых нередко называв также плесневыми грибами. К группе плесневых относят и некоторых представителей зигомицетов и несовершенных грибов.

Пенициллы и аспергиллы имеют хорошо развитый многоклеточный мицелий. Размножаются преимущественно конидиальным спороношением. Наблюдаются в виде налета голубого, зеленого, сизого, реже других цветов на продуктах растительного происхождения (варенье, томатной пасте, лимонах и апельсинах), отсыревших изделиях из кожи, обоях. Распространены в верхних горизонтах почвы.

Грибы рода Penicillium называют кистевиками, так как они образуют конидии на концах мутовчаторазветвленных конидиеносцев, напоминающих кисть руки. Иногда отдельный пучок конидиеносцев, выходящих из одной точки и отчленяющих конидии, напоминает рисовальные кисти.

Для рассмотрения строения конидиеносцев Penicillium glaucum препаровальной иглой вырезают кусочек мицелия (приблизительно 0,5 мм²) на границе между его зеленым и белым участками. (Гриб к занятию выращивают в чашке Петри; старые грибы с полностью зеленым мицелием не годятся для просмотра.) Осторожно с помощью двух препаровальных игл кусочек мицелия снимают со среды и помещают в каплю воды на предметное стекло. Сверху на мицелий кладут покровное стекло. Поскольку мицелиальная пленка гриба довольно толстая, может получиться так, что под покровным стеклом вода не будет целиком окружать исследуемый мицелий. В этом случае надо из капельницы добавлять воду под покровное стекло до тех пор, пока кусочек мицелия не будет со всех сторон окружен водой. Затем слегка надавливают на покровное стекло в центре стеклянной палочкой (или препаровальной иглой). Избыток воды можно удалить фильтровальной бумагой.

Препарат сначала просматривают при малом увеличении, уделяя основное внимание его краям, так как на них обычно хорошо видны кисти конидиеносцев. Когда подходящий участок найден, переходят с объектива 8х на объектив 40х и детально рассматривают кисточки. Во время просмотра при малом увеличении конденсор опускают, при переводе на объектив 40х снова регулируют освещенность поднятием конденсора.

Aspergillus, или леечная плесень, имеет обычно одноклеточные конидиеносцы шаровидно, булавовидно или грушевидно вздутые. На них располагаются параллельно друг другу короткие кеглеобразные стеригмы, каждая из которых отшнуровывает радиально цепочки конидий. Некоторые виды аспергиллов имеют два ряда стеригм. Вся головка конидиеносца с радиально расходящимися цепочками конидий напоминает наконечник лейки со струйками воды.

Для ознакомления со строением конидиеносцев аспергилла на примере Aspergillus niger препаровальной иглой берут небольшое количество мицелия на границе между черным и коричнево-бурым участками колонии и вносят в каплю воды на предметном стекле. Далее поступают так же, как и при просмотре пеницилла. В начальной стадии спорообразования Aspergillus похож на Мисог (бесцветные головки), затем с возрастом головки покрываются стеригмами, на которых развиваются споры. В результате получаются так называемые кудрявые головки. От мукора аспергилл всегда можно отличить наличием таких головок. У мукора головки гладкие — «лысые», так как споры его эндогенного происхождения (внутренние), а у аспергилла и пеницилла — экзогенные споры (внешние).

Дрожжи. По современным представлениям, дрожжи — это сборная группа одноклеточных микроскопических организмов, относящихся к разным классам грибов, преимущественно — к классу аскомицетов.

Диаметр клеток дрожжей колеблется от 8 до 15 мкм. Форма их разнообразна: эллипсовидная, грушевидная, округлая, цилиндрическая. Размножаются вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения — почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам относятся представители «культурных» дрожжей рода Saccharomyces (сахаромицеты), к делящимся — виды рода Schizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. В каждой сумке образуется от 2 до 8, иногда 12 спор. Среди дрожжей есть аспорогенные, ложные дрожжи, не способные к половому процессу и спорообразованию. Они относятся к классу несовершенных грибов.

С делящимися дрожжами можно познакомиться на примере Schizosaccharomyces pombe (schizo — рваться, делиться, saccharomyces — сахарный гриб, pombe — название африканского напитка, из которого этот организм выделен). Дрожжам размножение делением несвойственно, поэтому данный род дрожжей является отклонением от нормы. Шизосахаромицеты размножаются и половым путем, связанным со спорообразованием, что характерно для сумчатых грибов. Schizosaccharomyces pombe рассматривают на фиксированных, окрашенных фуксином препаратах. Это цилиндрической формы крупные клетки с округлыми концами. Размножение делением свойственно также дрожжам Рода Endomyces. Из почкующихся дрожжей наиболее «одомашнены» дрожжи пекарские — Saccharomyces cerevisiae. Форма их разнообразна. Размножаются они почкованием (вегетативный способ размножения) и аскоспорами. При почковании на материнской клетке возникает маленькая выпуклость — почка — дочерняя клетка, в которую переходит одно ядро. Клетка увеличивается в размерах и отделяется. Если условия для такого размножения благоприятны (достаточное количество сахара, соответствующая температура, аэрация), процесс идет очень быстро. У некоторых представителей рода клетки после почкования не успевают разъединяться и возникает псевдомицелий (ложный мицелий).

Для лабораторных занятий могут быть использованы, пекарские дрожжи. Небольшой кусочек дрожжевой массы за несколько часов до занятий помещают в теплую подсахаренную воду и ставят в теплое место. Образуется беловатая мутная жидкость. Каплю этой жидкости наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, сверху наносят каплю кедрового масла и просматривают препарат с иммерсионной системой. Клетки хорошо видны и при меньших увеличениях.

В пекарских дрожжах обычно присутствуют две расы: одна представлена округло-эллипсовидными клетками, быстро разъединяющимися при почковании; другая — удлиненно-цилиндрическими, образующими при почковании ветвистые кустики (псевдомицелий). На многих клетках видны почки. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей хорошо заметны крупные прозрачные вакуоли, занимающие иногда центральное положение.

С представителями аспорогенных дрожжей, размножающихся только почкованием и не образующих спор, можно познакомиться на примере Candida kefiri. Их клетки мелкие, диаметром около 5 мкм.

Размножение у дрожжеподобных организмов может происходить также в результате распада гиф на отдельные клетки — оидии, или артроспоры, как у Geotrichum candidum (Oidium lactis).

Материалы и оборудование:

Коллекцию культур следует пересевать каждые 2—3 месяца на свежие питательные среды: бактерии и актиномицеты — на мясо-пептонный агар, дрожжевые и плесневые грибы — на сусло-агар. За 2—3 дня до занятий культуры пересевают в пробирки (бактерии и актиномицеты) или чашки Петри (грибы) из расчета по две пробирки каждой культуры и одну-две чашки Петри на группу студентов из 10—15 человек. Для занятий необходимы микроскопы и все принадлежности к ним; предметные и покровные стекла; бактериологические петли (иглы); препаровальные иглы; свежий 5%-ный раствор фуксина.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 14

ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ

БЕЗАЗОТИСТЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

 

Молочнокислое брожение: микроскопирование молочнокислых бактерий, определение количества и качественные реакции на молочную кислоту.

Молочнокислое брожение лежит в основе силосования, квашения овощей, переработки молока в кисломолочные продукты и сыр; кислый вкус черного хлеба определяется молочной кислотой. Данные процессы вызывают молочнокислые бактерии, которые разнообразны и широко распространены в природе.

Молочнокислые бактерии обитают на поверхности растений, в молоке, на пищевых продуктах, в кишечнике человека и животных. Они имеют много общих признаков, важнейшими из которых являются:

-способность к синтезу молочной кислоты;

-грамположительность;

-отсутствие спор;

                 -неподвижность;

-форма (кокки или палочки);

     -требовательность к источникам азота (многие из них не развиваются на простых синтетических средах);

-отсутствие фермента каталазы;

-способность к расщеплению перекиси водорода до воды и кислорода.

Последнее свойство выявляется, если на колонию молочнокислых бактерий нанести каплю 3%-ного раствора перекиси водорода: выделение кислорода при этом не происходит. Колонии бактерий, синтезирующих каталазу, в таких условиях покрываются пузырьками кислорода.

Постановка опыта. Определив начальную кислотность молока титрованием 0,1 н. раствором NaOH, его разливают в колбы на 100 мл по 40—50 мл и закрывают ватными пробками.

Параллельно выполняют второй вариант опыта: разливают молоко в колбы, закрывают ватными пробками, ставят на асбестовые сетки и доводят молоко до кипения.

Колбы с кипяченым и некипяченым молоком помещают в термостат при 30°С. Через 10—12 ч некипяченое молоко скисает. В колбе образуется ровный плотный сгусток без следов газа (если в опыте используют молоко хорошего качества). Сгусток получается в результате реакции молочной кислоты с казеинатом кальция и выпадения казеиновой кислоты в осадок.

При кипячении молока молочнокислые бактерии, поскольку они не образуют спор, погибают, споры же масляно-кислых бактерий сохраняются. При инкубации в термостате они прорастают и осуществляют маслянокислое брожение лактозы. В результате реакции масляной кислоты с казеинатом кальция и в этом варианте опыта казеиновая кислота выпадает в осадок. В дальнейшем она подвергается пептонизации, в результате чего сыворотка приобретает кремовый цвет, неприятный запах масляной кислоты (запах пота) и прогорклый вкус.

Микроскопирование молочнокислых бактерий. Если простоквашу хранить при комнатной температуре, то на ее поверхности появляется белая или кремовая бархатистая морщинистая пленка. Такая же пленка обычно бывает на поверхности рассола при квашении огурцов, капусты и других овощей. Это молочная плесень — Geotrichum candidum (Oidium lactis), которая всегда сопутствует молочнокислому брожению, являясь его нежелательным спутником. Она окисляет молочную кислоту, образуемую молочнокислыми бактериями, до СО₂ и Н₂О, снижая кислотность среды. В результате кисломолочные и квашеные продукты начинают портиться, так как в среде происходит развитие гнилостных бактерий.

Молочная плесень — аэробная форма, поэтому развивается только на поверхности. Имеет многоклеточный мицелий, который распадается на отдельные клетки, так называемые оидии, по форме напоминающие дрожжи и служащие для размножения.

Для микроскопических наблюдений за молочнокислыми бактериями готовят препарат из прокисшего молока. Бактериологическую петлю вводят в сгусток и, повернув вокруг оси извлекают, прикасаясь ею к пленке, которую образует молочная плесень. Сгусток размазывают по предметному стеклу очень тонким слоем без воды. Сушат на воздухе. Фиксируют смесью спирта с эфиром (приблизительно 1:1), несколько раз нанося смесь на мазок и сливая ее. При такой фиксации не только погибают и прикрепляются к стеклу бактерии, но и с помощью эфира извлекается и удаляется жир, капли которого на препарате мешают окраске и микроскопированию.

Фиксированный препарат окрашивают метиленовым синим 2—3 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. Метиленовый синий — лучший краситель для молочнокислых бактерий молока, так как он слабо окрашивает основной фон (казеин) и хорошо — клетки микроорганизмов. На препарате преобладают мелкие округлые клетки Lactococcus lactis, соединенные в короткие цепочки. Эта бактерия — возбудитель естественного скисания молока в средних широтах. Оптимальная температура для ее развития — 30°С. Она способствует накоплению в молоке до 1% молочной кислоты.

Нередко на препарате видны разных размеров тонкие палочки обычно правильной формы рода Lactobacillus, иногда содержащие зерна волютина. Чаще встречается Lactobacillus bulgaricus — возбудитель естественного скисания молока в южных широтах. Оптимальная температура ее развития — 40°С, она кислотоустойчива, накапливает до 3,5% молочной кислоты. На плотных средах эта бактерия образует мелкие характерные колонии в виде комочков ваты, как правило, выпуклые, непрозрачные, непигментированные.

Если на поверхности прокисшего молока появилась пленка, то в мазке обнаруживается также и молочная плесень. Прямоугольные или овальные клетки ее отличаются от молочнокислых бактерий большими размерами.

Можно приготовить также фиксированные препараты из кисломолочных продуктов (йогурта, кефира, ацидофилина, ряженки, бифидока и др.) и зарисовать доминирующие формы. Препараты из силоса или квашеной капусты готовят следующим образом: сначала втирают в предметное стекло кусочек силосуемой массы (и<