ТЕМА 1. вирусологический метод исследования: культивирование вирусов

Вирусы характеризуются малыми размерами тела, отсутствием самостоятельных белоксинтезирующих и энергию генерирующих систем, выраженным цитотропизмом и облигатным внутриклеточным паразитизмом. Культивирование вирусов проводят в культурах клеток, органных культурах, развивающихся куриных эмбрионах, восприимчивых лабораторных животных. Широкое распространение получил предложенный в 1952 г Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вирусосодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при 37⁰С. Через 48 – 96 ч выявляются пятна – бляшки. Они имеют диаметр 1 – 3 м и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия (ЦПД) вируса. ЦПД вирусов может проявляться в виде следующих изменений:

1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (полиовирусы, вирусы Коксаки).

2. Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток (вирус гриппа, клещевого энцефалита).

3. Гроздевидная дегенерация клеток (аденовирусы).

4. Крупнозернистая равномерная деструкция клеток (вирус герпеса).

5. Симпластообразование (респираторно – синцитиальные вирус, вирус кори).

О росте вирусов в клетках можно судить и с помощью индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в жёлтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый. Некоторые вирусы, в частности, вирус гриппа, обладают особыми рецепторами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютининацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютининации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках культуры тканей).

Для культивирования и изучения вирусов используют органные культуры – небольшие фрагменты органов животных, культивируемые на поверхности плотной или жидкой питательной среды. В микробиологической практике для выделения, культивирования и идентификации вирусов используют куриные эмбрионы. Вирусы могут быть выделены их исследуемого материала путём заражения восприимчивых лабораторных животных (например, морских свинок, белых мышей, крыс белых, хомяков сирийских и т. п.).

ЗАДАНИЕ

1. Учесть результаты посева воздуха седиментационным методом (Коха).

2. Учесть результаты посева пробы почвы для определения перфрингенс – титра.

3. Произвести заражение куриных эмбрионов.

Техника заражения куриных эмбрионов

Отобрать свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводить в гнёздах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37 – 37,5⁰С, относительной влажности 63 – 65 %. Для заражения отобрать 4 – 13 – дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обработать спиртом, обжечь над пламенем и в области введения смазать 2 % йодной настойкой. Средств ввести в аллантоисную и амниотическую полости. Проколоть ножницами небольшое отверстие в скорлупе над воздушной полостью и ввести с помощью иглы шприца исследуемый материал в количестве 0,1 – 0,2 мл на глубину 1 – 2 см. Отверстие залить парафином. При заражении в полость амниона иглу шприца или пастеровскую пипетку направить к зародышу под контролем овоскопа и ввести исследуемый материал (закрытый способ заражения). При выполнении открытого способа заражения в скорлупе над воздушной полостью вырезать отверстие размерами 0,5 – 0,7 х 0,5 см, удалить скорлупную оболочку, вскрыть хорионаллантоисную оболочку, захватить пинцетом амниотические оболочки и ввести в полость исследуемый материал. Отверстие в скорлупе закрыть покровным стеклом, смоченным в расплавленном парафине. Зараженные КЭ поместить в термостат.

4. В готовых препаратах изучить характер внутриклеточных включений, образуемых вирусами.

Контрольные вопросы

1. Каковы особенности химического состава и структурной организации вирионов?

2. Какие признаки лежат в основе систематики вирусов?

3. Каковы особенности вирусных нуклеиновых кислот и белков?

4. Каковы формы взаимодействия вируса с клеткой хозяина?

5. Какими методами производится культивирование вирусов?

6. Что собой представляют перевариваемые тканевые культуры?

7. Что такое цитопатическое действие вируса и как оно может проявляться?

8. Какими методами производится заражение куриного эмбриона?

9. Что собой представляют внутриклеточные включения, образуемые вирусами?