ТЕМА 1. бактериологический метод. культивирование микроорганизмов: питательные среды и методы стерилизации

Культивирование микроорганизмов широко используется в лабораторных условиях для их выделения, накопления и сохранения. Для культивирования бактерий пользуются естественными и искусственными питательными средами различного состава. Питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

· содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества, соли и ростовые факторы;

· иметь оптимальную рН, вязкость достаточную влажность;

· должны быть стерильными и по возможности прозрачными.

По назначению питательные среды подразделяют на следующие основные категории:

· основные – предназначены для выращивания многих видов бактерий (мясо – пептонный бульон, мясо – пептонный агар);

· элективные – способствующие развитию отдельных видов микробов (кровяные, сывороточные, яичные);

· селективные – подавляющие рост одних микроорганизмов и не влияющие на рост других (среды Мюллера, селенитовая, Рапопорт);

· дифференциально – диагностические – позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям (среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гиса).

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, плотными и полужидкими. Жидкие среды готовят на основе водных растворов каких – либо веществ, чаще всего мясной воды, различных гидролизатов, иногда естественных продуктов (молока, крови). Для получения плотных сред к ним добавляют агар – агар, который представляет собой полисахарид сложного состава, получаемый из морских водорослей. Агар – агар плавится при 100⁰С, но при охлаждении сохраняет жидкую консистенцию до 45⁰С. Для получения плотных сред его добавляют в концентрации 1,5 – 3,0 %. Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агара (0,3 – 0,7 %).

Стерилизация – обеззараживание, полное уничтожение микроорганизмов в питательных средах, посуде и прочих различных материалах. Производится с помощью физических, химических и механических методов.

К физическим относятся:

а) прокаливание, или фламбирование, над пламенем горелки; б) кипячение; в) стерилизация сухим жаром; г) стерилизация паром под давлением – автоклавирование; д) стерилизация текучим паром; е) дробная стерилизация; ж) тиндализация; з) пастеризация; и) стерилизация УФ – лучами;к) стерилизация ионизирующим излучением (рентгеновские или гамма – лучи).

Химическая стерилизация проводится с помощью веществ, обладающих антимикробным действием. В качестве стерилизантов в настоящее время используют растворы карболовой кислоты или фенола (3 – 5 %), сулемы (0,1 – 0,2%), хлорамина (1 – 5 %), этиловый спирт, щелочи и кислоты различной концентрации.

Для обработки сред, компоненты которых легко разлагаются при нагревании, применяют механическую стерилизацию фильтрованием через мелкопористые фильтры (свечи Шамберлана, Беркефельда, фильтр Зейтца).

Демонстрация

1. Питательные среды: основные, элективные, селективные, дифференциально – диагностические.

2. Бактериальные фильтры.

ЗАДАНИЕ

1. Ознакомиться с устройством и работой автоклава и сушильного шкафа.

2. Приготовить питательный мясо – пептонный бульон, для чего в колбу со 100 мл дистиллированной воды поместить навеску пасты, содержащей концентрированный рыбный гидролизат, размешать, кипятить в течение 2 – 3 минут, определить рН (7,2 – 7,5), профильтровать, разлить в пробирки и простерилизовать в автоклаве.

3. Приготовить питательную среду из сухого агара, для чего всыпать в колбу со 100 мл дистиллированной воды навеску сухого порошка, размешать, кипятить на слабом огне 1 – 2 минуты, профильтровать, разлить по пробиркам. После автоклавирования пробирки оставить на столе в наклонном положении для застывания агара в виде скошенной поверхности (скошенный агар).

Контрольные вопросы

1. Какую роль выполняют вода, минеральные соли, углеводы и липиды в микробной клетке?

2. Как классифицируют микроорганизмы по типам питания?

3. Каковы особенности автотрофных и гетеротрофных микроорганизмов?

4. В чём состоит строительный и энергетический обмен у микробов?

5. Какие продукты образуются в результате строительного и энергетического обмена микроорганизмов?

6. Какие требования предъявляются к питательным средам? Что такое ростовые факторы?

7. Как классифицируются питательные среды? Привести примеры основных категорий питательных сред.

8. Что такое стерилизация и дезинфекция?

9. Какие существуют методы стерилизации питательных сред и лабораторной посуды?