ТЕМА 2. бактериологический метод исследования: выделение чистых культур

Основными задачами бактериологического метода являются:

1) получение чистой культуры какого – либо вида из микробной ассоциации (из внешней среды или из организма человека) и предупреждение контаминации посторонней микрофлорой исследуемого материала;

2) идентификация микробов выделенной чистой культуры;

3) определение дополнительных средств, например, чувствительности к антибиотикам, вирулентности.

В основе бактериологического исследования лежит получение чистых культур, т. е. совокупности микробов одного вида, полученных из одного образца материала и содержащихся в определенном объеме среды.

Выделение чистых культур бактерий состоит из 3 – х этапов:

1) посев исследуемого материала на плотные питательные среды для получения изолированных колоний;

2) исследование колоний;

3) пересев с выбранных колоний на скошенный в пробирке МПА или специальную среду.

Существуют различные техники первичного исследуемого материала на питательные среды для получения изолированных колоний:

Техника посева на чашки Петри бактериологической петлей

Петлю исследуемого материала наносят на агар около края чашки и растирают на небольшом участке, затем, не отрывая петли, засевают материал на всю поверхность среды параллельными штрихами с интервалом 4 – 5 мм (рис. 1а). Посев можно производить и следующим способом: делается 4 – 5 параллельных штрихов в направлении А, затем петля прожигается в пламени горелки и ею проводятся штрихи в направлении Б поперек первоначально нанесенных полос. Петля снова прожигается, и делаются штрихи в направлении В, а затем и в направлении Г (рис. 1б). Ещё один вариант посева петлей заключается в том, что чашку со средой делят на 4 – 5 радиальных секторов и одной и той же петлей поочередно делают посевы на всех секторах (рис. 1в).

А

Б

Г

 

В

 

а б в

 

Рис. 1. Варианты посева петлей

 

Техника посева шпателем (метод Дригальского)

Берут 3 чашки Петри с плотной питательной средой. На середину первой петлей или пастеровской пипеткой вносят каплю исследуемого материала и круговыми движениями шпателя производят сплошной посев. Этим же шпателем, не стерилизуя его, распределяют материал по второй и третьей чашкам.

Техника посева тампоном

Первоначально тампоном, поворачивая его разными сторонами, проводят на чашке со средой диагональную дорожку шириной 1 – 2 см, затем штрихами петли через дорожку засевают среду по обе её стороны. Во втором варианте один из радиальных секторов чашки засевают тампоном, а затем поочередно остальные секторы – петлей с заходом каждый раз на уже обработанную тампоном поверхность.

Техника посева в толщу плотной среды (метод Коха)

Готовят 10 – кратные разведения материала в стерильном изотоническом растворе хлористого натрия и вносят по 1 мл каждого разведения в пробирки с 9 мл расплавленного и остуженного до 45 – 50⁰С агара. После тщательного перемешивания содержимое каждой пробирки выливают в стерильную чашку Петри. Метод применим при количественных исследованиях.

Техника посева проб исследуемого объекта (отпечатки)

Свежий срез объекта (например, кусочков органов, пищевых продуктов плотной консистенции) берут пинцетом и прикасаются к поверхности агара в соответствующем участке чашки Петри.

Получив изолированные колонии, из колоний с различной характеристикой или содержащих различные по форме и окраске бактерии делают пересев бактерий. Выделяют следующие техники пересева:

Техника посева проб в пробирки со скошенной средой

Обычно на скошенные среды переносят культуру с колоний на чашках. Для этого необходимо приподнять крышку чашки Петри и стерильной петлёй прикоснуться к колонии. После этого в левую руку берут пробирку со скошенным агаром (между большим и указательными пальцами) так, чтобы поверхность скошенного агара была перед глазами. Пробирку открывают над пламенем горелки, обжигают её край, а затем петлю вводят в пробирку до дна, где имеется небольшое количество конденсационной воды. Плоской поверхностью петли прикасаются к поверхности агара и делают посев штрихообразными движениями, постепенно продвигаясь снизу вверх. Обжигают в пламени край пробирки и пробку, закрывают пробирку над пламенем.

Техника посева в жидкую среду

Простерилизованной бактериологической петлей отбирают материал, наносят его на стенку пробирки у верхнего уровня среды и, слегка встряхивая пробирку, смывают его средой. Край пробирки и пробку обжигают, быстро закрывают.

Техника посева бляшкой

При определении некоторых свойств исследуемых культур бактерий на плотных средах производят плотный посев на ограниченном участке среды в виде прямоугольника, овала, круга размерами 0,5 – 0,8 х 1 – 1,5 см. Между бляшками следует выдерживать расстояние в несколько см.

Техника посева в конденсационную воду

Выбирают свежескошенную среду, содержащую на дне каплю конденсационной жидкости. Исследуемую культуру забирают петлей и вносят в конденсационную воду. У выражено подвижных культур рост бактерий с конденсационной воды распространяется на влажную поверхность скошенной среды. С верхней части роста бактерий производят пересев в конденсационную воду второй пробирки и т. д. Методика позволяет получить чистую культуру подвижных бактерий (например, протея, возбудителя столбняка).

Техника посева в верхнюю часть скошенной среды

Материал наносят в виде бляшки на верхнюю часть свежескошенной среды. Пробирки помещают в термостат в вертикальном положении и наблюдают за сползанием культуры вниз по поверхности скошенной части, которое характерно для слизистых штаммов.

Техника посева уколом в столбик плотной или полужидкой среды

Используют высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, полускошенные плотные среды. Во всех случаях бактериальной петлей или иглой с посевным материалом делают прокол среды с поверхности до дна. Пробирку рекомендуют держать дном вверх, чтобы не наступила контаминация среды воздушной микрофлорой.

После инкубации изучают изолированные колонии. Колонии обладают набором определенных признаков:

а) размеры – большие (диаметр более 4 – 5 мм), средние (диаметр 2 – 4 мм), мелкие (диаметр менее 1 – 2 мм) и микроскопические (диаметр менее 1 мм);

б) цвет – белый, жёлтый, сине – зелёный, бурый, чёрный, цвет среды и др.;

в) форму – круглая, лаптеобразная, розеткообразная и др.;

г) края – ровные, волнистые, зазубренные, отростчатые и др.;

д) поверхность – гладкая, шероховатая, блестящая, матовая, плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная и др.;

е) консистенция – сухая, пастообразная, слизистая, однородная, зернистая;

ж) прозрачность – прозрачная, мутная.

Для определения морфологии клетки и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму. Оставшуюся часть колонии отсевают на скошенный питательный агар.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых сводится к удалению кислорода из среды. Условия анаэробиоза создают различными способами:

1. Физические:

а) удаление воздуха при помощи насоса из герметически закрывающегося прибора – анаэростата;

б) удаление воздуха из среды при помощи кипячения с последующим быстрым охлаждением и заливкой среды стерильным вазелиновым маслом;

в) внесение в жидкую питательную среду кусочков печени, мяса, почки, которые поглощают кислород;

г) посев в высокий столбик агара, который затем заливается слоем вазелинового масла для предотвращения доступа воздуха;

д) использование трубок Вейон – Виньяля: в стеклянную трубку длиной около 30 см и диаметром 3 – 4 мм насасывают расплавленный агар, засеянный микробами, трубку запаивают с обоих концов, для выделения колоний у нужного места трубку надламывают и производят отсев бактерий.

2. Химические:

а) добавление в питательную среду веществ, редуцирующих кислород (например, глюкозу, глутатион, пировиноградную кислоту и др.);

б) добавление в атмосферу роста химических веществ, поглощающих кислород (например, щелочного пирогаллола).

3. Биологический (метод Фортнера): совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов на кровяном агаре с глюкозой в запаранифинированной чашке Петри.

ЗАДАНИЕ

1. Рассеять смешанную культуру на питательные среды для получения изолированных колоний, используя при этом различные техники посева.

2. Изучить колонии на чашках: определить размеры колоний, форму, поверхность, характер края, прозрачность колонии, наличие пигмента, консистенцию. Из части колонии приготовить мазок, окрасить по Граму, микроскопировать. Зарисовать и записать морфологию бактерий.

3. Отсеять оставшуюся часть колонии на скошенный питательный агар.

4. Ознакомиться с методами создания анаэробиоза.

Контрольные вопросы

1. Что представляет собой процесс дыхания у микробов?

2. На какие типы разделяют микроорганизмы по способу дыхания?

3. Каковы характерные черты аэробного типа дыхания?

4. В чём особенности анаэробного типа дыхания? Что такое брожение?

5. Какие существуют методы создания анаэробиоза?

6. Как происходит размножение бактерий?

7. Что такое «число бактерий» и «микробная масса»?

8. перечислить фазы развития бактериальной популяции в жидкой питательной среде?

9. Что такое время генерации бактерий и как оно определяется?

10. В чём заключается способ непрерывного культивирования бактерий?

11. Что такое «синхронная культура» и как её получают?

12. Что собой представляет чистая культура бактерий?

13. Какие этапы включает выделение чистых культур бактерий?

14. Какие существуют техники первичного посева исследуемого материала?

15. Какие существуют техники пересева бактерий?

16. Какие признаки колоний имеют дифференциальное значение?

17. Какую роль играют пигменты бактерий?

18. Почему пигмент у одних бактерий окрашивает только колонии, а у других – колонии и питательную среду?