Бактеріофаги, їх види, життєвий цикл фага, трансдукція, метод упакування ДНК фага в зрілий капсид in vitro.

Бактеріофаги, або просто фаги, - це віруси бактерій. Вони здатні проникати у живі клітини і лише в них відтворюватися. У більшості випадків фагові часточки – віріони, складаються з ДНК (або РНК) і білку, що створює оболонку (головку, або капсід) навколо нуклеїнової кислоти і хвостовий відросток.

Життєвий цикл фага починається з моменту зіткнення фагової часточки з клітиною (рис.7). Фаг прикріплюється своїм відростком до оболонки клітини і за допомогою ферменту, що міститься у відростку, або механічним шляхом, руйнує незначну ділянку клітинної стінки бактерії і через отвір, що створився, вводить власну хромосому у клітину.

В бактеріальній клітині відбувається множинна реплікація хромосоми фага і синтез під контролем фагових генів білків головки і відростку. Потім створюються нові фагові оболонки, в них пакуються фагові хромосоми, таким чином, що одразу виникає велика кількість (від 100 до 1000) фагових часточок. Цикл закінчується лізисом (розчиненням, руйнуванням) бактеріальної клітини і виходом зрілих фагових часточок назовні.

Вірулентні фаги (наприклад, фаг Т4 Е.соІі) завжди лізирують бактерії, що були їм інфіковані, і мають лише один шлях розвитку – літичний цикл. Помірні фаги (наприклад, фаг ? або Р1 Е.соІі) можуть поводитися різним чином: після проникнення у бактеріальну клітину хромосома фагу або залучається до літичного циклу, або вступає з клітиної-господарем у своєрідні симбіотичні відносини – перетворюється на профаг і передається усім нащадкам даної клітини.

Інколи, в процесі розмноження фагів у бактеріях створюються часточки, які поряд з фаговою ДНК або замість неї містять фрагменти бактеріальної ДНК. Такі часточки мають назву трансдукуючі. За своїми властивостями вони не відрізняються від звичайних фагових віріонів, але при зараженні ними нових клітин вони передають їм генетичні детермінанти попередніх господарів. Таким чином відбувається процес трансдукції, тобто трансдукція – це перенесення генетичної інформації від клітини-донора до клітини-реципієнта за допомогою фагу.   

Широке використання фагових векторів почалося після відкриття способу упакування ДНК фага в зрілий капсід in vitro. Для з’ясування цього питання необхідно розглянути, яким чином відбувається літичний цикл розвитку фага ?. Інфекційна фагова часточка має головку, у якій щільно упакована ДНК довжиною приблизно 50 т.п.н., і відросток з тонкими білковими нитками (фібрилами), що відходять від нього. ДНК фага ? – це лінійна дволанцюгова молекула з одноланцюговими 5?-„хвостами”, що складаються з 12 нуклеотидів, так званими липкими cos-кінцями, вони взаємно комплементарні і здатні з’єднатися один з одним. Після того як фагова ДНК потрапляє у бактеріальну клітину, cos-кінці з’єднуються і створюється кільцева молекула, яка здатна до реплікації. В процесі реплікації синтезується лінійна молекула, вона складається з декількох сегментів довжиною 50 т.п.н. Кожен з цих сегментів упаковується в білкову головку, до останньої приєднується вже зібраний відросток і створюється нова фагова часточка. Сегменти довжиною 50 т.п.н. у лінійної молекулі ДНК відокремлені cos-сайтами, і по цих сайтах розрізається молекула, коли наступний сегмент заповнює головку фага. Розрізання відбувається ферментом, що знаходиться у входу в головку. При упакуванні сегментів довжиною менш 38 т.п.н. створюється неінфекційна фагова часточка, а сегменти довжиною більше 52 т.п.н не поміщаються в головку. Зборка інфекційного фага ? in vitro відбулася при змішуванні у пробірці пустих головок, фагової ДНК і зібраних відростків.  

 

 

15. Транспозони, види транспозицій.

Транспозони, повсюдно поширені в живій природі, є мобільними генетичними елементами, що мають здатність переміщатися з однієї частини генома в іншу шляхом вирізання й наступної інтеграції за механізмом, незалежним від гомологічної рекомбінації. Окремі представники цієї великої родини мобільних генетичних елементів бактерій дуже розрізняються за своєю структурою й механізмами внутрішньогеномного переміщення. Відомо вже, принаймні, чотири механізми транспозиції. За консервативної транспозиції транспозон вирізується з решіікона-донора й у незмінному вигляді- інтегрується в реплікон-реципієнт. Пролом, що створюється у вихідному репліконі, відновлюється внаслідок репарації/ Реплікативна транспозиція характеризується тим, що транспозон не вирізається з локуса, в якому він розташований. Замість цього реплікон-донор і реплікон-реципієнт створюють коінтеграт (об'єднуються один з одним), у процесі формування якого виникає друга копія транспозону. Внаслідок наступного за цим поділу репліконів, кожний з них стає власником копії вихідного транспозону. Процес поділу коінтеграта здійснюється за допомогою гомологічної рекомбінації або за участю сайт-специфічної рекомбінази (резольвази), що кодується транспозоном і розпізнає специфічні послідовності {res). У процесі шсцжійної транспозиції сайт-специфічна ендонуклеаза (інтеграза) за участю інших білкових факторів вирізає транспозон з реплікона-донора, відновлюючи кільцеву структуру реплікона. При цьому одночасно утворюється кільцевий ковалентно замкнений мобільний елемент як проміжна сполука, що вбудовується в реплікон-реципієнт. Нарешті, у процесі ретротранспозиції має місце транскрипція ретротранспозона з утворенням РНК, що за участю матурази віддаляється з вихідної РНК та інтегрується в безінтронну РНК, не обов'язково того ж виду, що й РНК-донор (зворотний сплайсинг). Далі РНК-реципієнт за допомогою зворотної транскрипції перетворюється в кДНК й інтегрується в реплікон-реципієнт за механізмом RecA-залежної гомологічної рекомбінації. Альтернативно, зрідка, транскрипт ретротранспозона, що містить інтрон, може за допомогою зворотного сплайсинга вбудовуватися в один із ланцюгів розплетеної дволанцюгової ДНК-реципієнта. Після внесення в другий ланцюг ДНК одноланцюгового розриву за допомогою ендонуклеази, 3'-кінець ДНК, що створився, стає місцем ініціації зворотної транскрипції на матриці інтегрованої РНК, що приводить, в остаточному підсумку, до утворення дволанцюгової ДНК із вставкою послідовності ретротранспозона. Всіма трьома видами активності: зворотної транскриптази, матурази й ендонуклеази володіє білок, що кодується геном іер (intron encoded protein), локалізований в інтроні ретротранспозона.

За вибором місць інтеграції в реплікон-реципієнт транспозони поділяють на три групи. Деякі з них, наприклад, Тп5 і бактеріофаг Ми, інтегрують у геном випадковим чином, інші вбудовуються в обмежене число ділянок ДНК, для третіх характерна сайт-специфічна інтеграція. Саме здатність ряду транспозонів вбудовуватися випадково у геном клітини- власника часто використовується сучасною молекулярною генетикою для клонування невідомих послідовностей і картирування генома.

Вбудовування транспозону в результаті транспозиції в частину гена, що кодує, як правило, його інактивує, що супроводжується розвитком відповідного фенотипу. Фрагмент ДНК із транспозоном може бути виділений із клонотеки послідовностей за допомогою зондів, для створення яких використовуються послідовності транспозони. Оскільки послідовності транспозонів, що використовуються у такій роботі, відомі, не виникає ускладнень за допомогою відповідних рестриктаз виділити транспозон разом із фланкуючими його невідомими послідовностями нуклеотидів. За допомогою набору рестриктаз можна по'будувати детальну фізичну карту невідомих послідовностей, що прилягають до інтегрованого транспозону, і здійснити подальше пересування у напрямку невідомих послідовностей в обидва боки від транспозону.

 

 

16. Інтерферони, способи їх синтезу, гібридні інтерферони.

Виявилось, що існує три групи ІФ: ?-ІФ, що утворюються при дії вірусів на лейкоцити; ?-ІФ, що утворюються при дії вірусів на фібробласти; ?-ІФ, що називаються також імунні, оскільки утворюються Т-лімфоцитами у відповідь на вплив бактеріальних, або вірусних антигенів. Всі три типи відрізняються один від одного і володіють різними фізико-хімічними властивостями. 

Було з’ясовано, що клас ?-ІФ складається з декількох білків і кількість генів, що їх кодують біля 20. ?-ІФ представлений індивідуальним білком , якому відповідає один ген. Для ?-ІФ доки виділений тільки один білок, однак вважають, що існує декілька генів, що кодують різні ?-ІФ. При виділенні кДНК цих ІФ були вимушені розробити новий підхід, для подолання труднощів, що пов’язані з недостатньою кількістю відповідних мРНК і білків. Для цього було зроблено наступне:

-      з лейкоцитів виділили мРНК розрізали по сайтах рестрикції і вбудували в плазмідні вектори;

-      за рахунок трансформації ввели ці вектори в клітини Е.со1і, створилося 6000 клонів, всі клони розділили по групах і провели тестування;

-      після тестування з ІФ-мРНК відділили гібриди з неї, відокремили мРНК і створили умови для трансляції з неї білків;

-      визначили ІФ-активність проти вірусів кожної групи;

-      кожну групу знов розділили на підгрупи і знов зробили тестування. Розділення і тестування робили до того часу, коли був ідентифікований клон, що містить повнорозмірну ІФ-кДНК людини.

 

Було виявлено, що ІФ – відносно короткі білки , що складаються з 146-166 амінокислотних залишків. На першій стадії вони синтезуються у вигляді попередників, що містять на ланцюзі сигнальний пептид, який потім відщеплюється і утворюється зрілий ІФ.

Для того, щоб забезпечити синтез чужорідного білку у бактеріях, необхідно: а) ввести ген цього білку у вектор, наприклад, в плазміду; б) приєднати до нього бактеріальні регуляторні елементи, що будуть програмувати його транскрипцію і трансляцію в бактерії.

Кожен з ІФ має власні особливості, їх дослідження і порівняння з структурними характеристиками дає можливість покращити корисні властивості ІФ шляхом спрямованих змін їх генів. Якщо кожен з відповідних генів розрізати в певному місті однією і тією ж самою рестриктазою, а потім до фрагменту 1 гену додати фрагмент 2 і навпаки, то можна отримати гібридні гени, які після введення їх в клітину-реципієнту будуть програмувати синтез гібридних ІФ. Це було зроблено і виявилось, що в ряді випадків властивості гібридів різко відрізняються від початкових індивідуальних ІФ.  

 

 

Шляхи синтезу інсуліну.

Інсулін. Одним з важливих для медицини білків є інсулін людини. Це невеликий глобулярний білок, що містить 51 амінокислотний залишок і складається з двох поліпептидних ланцюгів (А і В). Ланцюги пов’язані між собою дісульфіднимі зв’язками. Інсулін синтезується на рибосомах в вигляді одноланцюгового попередника – препроінсуліну, який містить N-кінцевий сигнальний пептид і С-пептид, який складається з 35 ланок і є з’єднувальним пептидом. У клітині при віддаленні сигнального пептиду генерується проінсулін, який складається з 86 амінокислотних залишків, в якому С-пептид з’єднує А- і В-ланцюги інсуліну і забезпечує їх необхідну орієнтацію при замиканні дісульфідних зв’язків . Після протеолітичного відщеплення С-пептиду створюється інсулін.

В цей період було розроблено два шляхи синтезу інсуліну: в США з тканини людини була виділена мРНК інсуліну, на підставі якої за допомогою ревертази синтезована кДНК і клонований ген проінсуліну людини; другий шлях полягав в тому, що ген проінсуліну був синтезований хіміко-ферментативним способом. Цей підхід має декілька переваг. По-перше, необхідну структуру ДНК можна отримати з урахуванням експресії в різних організмах, тобто ввести в певні місця необхідні сайти рестрикції, по-друге, хімічний синтез виключає найбільш складний етап – виділення з природного джерела відповідної мРНК або геномної ДНК. У третіх, він спрощує модифікацію гену і білку, який з нього отримують. Загальна конструкція гену передбачала також проведення його клонування і експресії у складі бактеріальної плазміди. В структуру синтетичного полінуклеотиду крім триплетів, що кодують амінокислоти проінсуліну, були введені кодони ініціації і термінації трансляції, а також "ліпкі кінці" для введення гену у векторну молекулу. Експресія гену відбувалась за допомогою регуляторних елементів, що містять промотор і послідовність Шайн-Делгарно. Синтез гену включає декілька етапів: 1 – це синтез більш ніж 40 олігонуклеотидів – сегментів, з яких складається весь ген; 2 – це ферментативна зборка синтезованих сегментів за допомогою ДНК-лігази. Двохланцюгові полінуклеотиди довжиною 286 пар основ, що були отримані, вбудовувались в плазмідні вектори. Потім, після добудування і корекції регуляторних ділянок ДНК, що забезпечують експресії генетичного матеріалу, гени були введені в бактеріальні клітини. Штами, що отримані, є продуцентами проінсуліну, який може бути перетворений в активний інсулін. В наш час такий інсулін широко використовується в медичній практиці для лікування цукрового діабету.

 

 

18. Соматотропін, його активні центри, особливості створення кДНК, шляхи регулювання синтезу соматотропіну в організмі тварин.

Соматотропін. В 40-х роках 20 століття був встановлений стимулюючий ефект екстракту гіпофіза на ріст тварин і величину надоїв у корів. Визначено, що цієї вплив здійснює соматотропін – гормон росту (ГР). ГР є складним поліфункціональним білком, який бере участь в процесах стимуляції росту (соматогенна активність), посиленні діяльності молочних залоз (лактогенна активність), впливає на обмін вуглеводів та ліпідів. Це визначає, що ГР в різних типах клітин здатний зв’язуватися як з рецепторами, які відповідають за збільшення синтезу білку, розвиток м’язів і скелету та ін., так і з пролактиновими рецепторами. Використання одного з активних центрів гормону (центру росту, центру діяльності молочних залоз, центру інсуліноподібної дії та центру антиінсулінової дії) надасть можливість вибірково здійснювати вплив на функціонування організму. Це тим більш важливо, що проведені дослідження виявляють інколи при використанні ГР одночасне збільшення росту тварини і виникнення в неї діабету. Вирішити цю проблему можна двома шляхами. Оскільки ген ГР має складну структуру і містить інтрони, то процедура клонування починається з отримання кДНК на підставі мРНК за допомогою ревертази. Створюються гомогенні фрагменти ДНК довжиною 531 п.н., до яких потім ферментативним шляхом приєднують регуляторні елементи для забезпечення експресії цього рекомбінантного гена у клітині – реципієнті. На етапі створення кДНК можна за допомогою рестриктаз відокремити певні центри активності і в подальшому використовувати міні-гени ГР із спрямованою дією. Другий шлях полягає в тому, щоб зменшити зв’язування гормону з рецепторами тих клітин, стимуляція яких не бажана. Для цього в отриманих фрагментах кДНК здійснюють сайт-специфічний мутагенез (мутацію в певних ділянках ДНК), внаслідок якого відбувається заміна одних амінокислот на інші, завдяки цьому високо специфічні рецептори певних клітин не розпізнають гормон, зв’язування не відбувається і модифікований гормон росту зв’язується лише зі „своїм” рецептором.

Оскільки ГР є видоспецифічним, крім ГР людини були отримані за допомогою генної інженерії препарати ГР для великої рогатої худоби, свиней, кролів та ін. Ін’єкції бактеріального препарату коровам збільшують надій від 10 до 50% залежно від умов годівлі і утримання. Причому підвищення надою спостерігається як у низькопродуктивних, так і високоудійних корів. Позитивні результати одержані також при використанні ГР бактеріального походження в м’ясному тваринництві. Добові прирости в залежності від виду тварин, умов утримання та дози гормону змінювалися в межах 20-30%, що сприяло скороченню часу нагулу молодняку.

Відомо, що в організмі тварини синтез ГР регулюється за допомогою релізінг-факторів гіпоталамусу, які у власну чергу поділяються на ліберини і статини. Соматоліберин (СЛ) посилює синтез ГР, а соматостатин (СС) – пригнічує синтез ГР. СЛ – це білки, які складаються з 44 амінокислот, вони також є видоспецифічнимі. Гени ряду СЛ були клоновани і використовувались для ін’єкцій тваринам. Внутрівенні введення СЛ викликає швидку стимуляцію секреції ГР у кровоток і здійснює такий самий вплив, як і введення препаратів ГР.

Інший шлях збільшення синтезу ГР полягає в пригніченні створення релізінг-фактору СС. Найбільш просто і ефективно можна забезпечити зниження концентрації СС в крові за допомогою антитіл, проводячи для цього пасивну, або активну імунізацію. В першому випадку імунізують модельних тварин, від яких можна одержати значну кількість антисироватки. АнтиСС антитіла після внутрівенного введення тваринам, викликають швидке зниження концентрації СС в крові. В іншому випадку, імунізують безпосередньо ту тварину, в крові якої бажають знизити концентрацію СС. Використання антиСС антитіл в дослідах з ягнятами викликало на 13-му тижні збільшення маси в імунізованих ягнят на 76% в порівнянні з контролем. У телят підвищення ефективності приростів під впливом антиСС антитіл в середньому складало 27% при скороченні часу відгодівлі на 20%.

При аналізі якості м’ясних продуктів від тварин з прискореним ростом, обумовленим антиСС антитілами, відзначають збільшення м’язової маси та зниження вмісту жиру.

Поряд з гормонами за допомогою генної інженерії можна створювати і інші препарати для тваринництва, наприклад такі, як інгібітори протеаз та ?-антагоністи. Інгібітори протеаз зменшують швидкість розпаду білків і сприяють накопиченню м’язової маси, ?-антагоністи змінюють метаболізм жирів і здатні зменшувати відкладення жиру та підсилювати утворення м’язової тканини.