Методи визначення нуклеїнової послідовності: хімічне і ферментативне секвенування.

Секвенування – визначення нуклеотидної послідовності. Методи, що надали можливість ідентифікувати генетично важливі ділянки ДНК, мають велике значення. Існують два основні методи секвенування: хімічний і ферментативний.

Хімічне секвенування засновано на вибіркової хімічної деградації нуклеотидів. Для цього методу необхідно отримати одноланцюгову молекулу ДНК, на одному з кінців якої роблять радіоактивну мітку за допомогою ізотопу фосфору 32Р, препарат міченої ДНК поділяють на чотири порції і кожну обробляють реагентом, який специфічно руйнує одну, або дві з чотирьох основ. Необхідно підібрати умови реакції таким чином, щоб на одну молекулу припадало лише декілька пошкоджень. При обробці піперидином в ДНК утворюється розрив в тому місті, де знаходилася зруйнована основа.    

В результаті створюється набір мічених фрагментів, довжина яких визначається відстанню від зруйнованої основи до кінця молекули. Фрагменти, що створилися в усіх чотирьох реакціях, піддають електрофорезу на чотирьох доріжках в акриламідному гелі, потім роблять радіографію, і фрагменти, що містять радіоактивну мітку, залишають „відбитки” на рентгенівський плівки. По їх положенню можна визначити, на якої відстані від міченого кінця знаходилася зруйнована основа. Таким чином , на підставі набору смуг на рентгенівської плівки визначають нуклеотидну послідовність фрагменту, що аналізується.

За допомогою цього методу вдалося встановити багато послідовностей різноманітних ДНК, але він має ряд недоліків, що пов’язані з тривалістю і трудомісткістю процедур.

В наш час найбільш широко використовується метод ферментативного секвенування, або метод секвенування шляхом термінації (зупинки синтезу) ланцюгу, запропонований Ф.Сенгером у 1977р. В основі методу Сенгера лежить принцип реплікації комплементарного ланцюгу ДНК на одноланцюгової матриці, при тому що під час реплікації відбувається термінація - припинення синтезу дочірнього ланцюгу у різних місцях, а наступний ланцюг знов починає синтезуватися від початку матриці до наступної термінації. Основним моментом ферментативного секвенування є термінація синтезу ланцюгу, що будується. Агентами термінації, які викликають зупинку реплікації, є дидезоксинуклеотиди (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ) – це нуклеотиди позбавлені 2'- і 3'-гидроксильної груп при вуглеводних атомах цукрового кільця і тому подовження ланцюгу, яке відбувається за рахунок приєднання чергового нуклеозидтрифосфату до гідроксильної групи, припиняється.              

     Оскільки метод секвенування заснований на процесі реплікації ДНК, то основним ферментом є ДНК-полімераза. В присутності одноланцюгової ДНК-матриці, короткого полінуклеотидного праймеру і нуклеотидів за принципом компліментарності буде відбуватися синтез другого ланцюгу ДНК. При цьому подовження ланцюгу здійснюється до того часу, коли замість дезоксинуклеотиду не приєднається дидезоксинуклеотид. Приєднання останнього викликає зупинку синтезу.

В пробірках збирають чотири реакційні суміші, які мають однаковий склад: фрагмент ДНК-матриці, в якої визначають нуклеотидну послідовність, чотири дезоксинуклеотиду в достатньої кількості для здійснення росту комплементарного ланцюгу, радіоактивно помічений короткий праймер, комплементарний фрагменту ДНК-матриці, з якого ДНК-полімераза подовжує синтез. В кожну пробірку потім додають лише один з дидезоксинуклеотидів. В кожної пробірці буде відбуватися термінація ланцюгу, що синтезується, лише в тому місті, де ДНК-полімераза буде приєднувати дидезоксинуклеотид, який був доданий у реакційну суміш, тобто в одної пробірки синтез припиняється при приєднанні до комплементарного ланцюгу ддАТФ, в іншої – ддГТФ і т.д. Оскільки обрив ланцюгу відбувається у випадкових місцях, то створюється набір фрагментів усіх можливих довжин, починаючі з праймеру до кінця фрагменту, що досліджується.

Фрагменти ДНК, що були отримані розділяють у поліакриламідному гелі (з точністю до одного нуклеотиду), проводять радіографію і на підставі картини розподілу фрагментів у чотирьох пробірках встановлюють нуклеотидну послідовність.  

Використання флуоресцентних барвників, пов’язаних з нуклеотидами термінації, дозволяє проводити усі реакції в одній пробірці. Крім того, розроблені принципово нові підходи до секвенування, наприклад, секвенування шляхом гібридизації з фіксованими олігонуклеотидними чіпами, секвенування з використанням екзонуклеаз та інші. Усі ці методи дозволяють досить швидко вирішувати проблеми секвенування як великих ділянок ДНК, так і будь яких геномів. Отримані дані вносять у бази даних – банки генів.

 

 

8. ПЛР-ампліфікація, реакції з яких складається процес, ферменти, що використовуються для здійснення ПЛР.

Полімеразна ланцтбгова реакція Чисельні (амшгіфіковаш у мільйон разів) копії певних фрагментів ДНК отримують in vitro за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), яку попвдрено використовують у наш час. Вперш її запропонували у 1985 році РЛССейки, СіІІарф, Ф.Фалуна, К.Б.Муллис, Г.Е.Хорн, Х.А.Ерліх і НАрнхейм. ПЛР високо специфічна і чутлива, за її допомогою можна виявиш, розмножити і дослідити навіть одиничну копію гена у вихідному матеріалі. Зазвичай ЗО циклів ампліфікації протікає протягом трьох годин.

Для здійснення ПЛР необхідне:

два синтетичних олігонуклеотидних праймери (короткі олігонуклеотиди, які гібридизуються із матрицею і слугують запалом при її копіюванні), довжиною приблизно 20 нухлеотидів, комплементарні ділянкам ДНК з протилежних ланцюгів, що фланкирують (оточують) послідовність-мішень, яку розмножують; & 3'-гідроксильні кінці після отжигу (процес утворення дволанцюгових молекул (ДНК-ДНК або ДНК-РНК) з о дно ланцюгових полінуклеотидних комплементарних ланцюгів) з ДНК повинні бути орієнтовані назустріч один одному; ДНК-мішень довжиною від 100 до ~ 35 000 п.н.; термостабільна ДНК-полімераза, яка не втрачає активність при "теШературІ 95°СІвшце,г

чотири дезоксирибонуклеотиди. Типова ПЛР-ампліфікація складається з багаторазового повторення наступних реакцій.

1.Деншпуршіія, Перший етап ПЛР полягає в теплової денатурації зразка ДНК витримуванням його при температурі 95°С протягом по крайній мірі 1 хв. Крім ДНК, в реакційної суміші міститься надлишок двох праймерів, термостабільна ДНК-полімераза Taq, що виділена з бактерій Thermus aquaticus, і чотири дезоксирибонуклеотида.

2.Ренатурація. Температуру суміші повільно знижують ~ до 55°С, при цьому праймери спаровуються із комплементарними послідовностями ДНК.

3.Синтез. Температуру підвищують до ~ 75°С - величини, оптимальної для ДНК-полімерази Taq. Починається синтез комплементарного ланцюгу ДЙК, що ініціюється 3'-гідроксильною групою праймера (рис. 16).

В першому циклі після денатурації ДНК і зв'язування із нею праймерів ДНК-полімераза створює дволанцюгові структури, в яких батьківські ланцюга ДНК поєднані із знов синтезованими комплементарними ланцюгами різної довжини, але із фіксованим 5'-закінченям. Уже у другому циклі створюються два ланцюги специфічної послідовності, що мають задані розміри. У третьому циклі ці ланцюги дають начало дволанцюговим детермінованим за розміром фрагментам ДНК. У кожному наступному циклі їх кількість подвоюється, і теоретично Досягає у 22 циклі, а на практиці у ЗО циклі більше мільйона копій.

Вихідні молекули ДНК і структури, що створилися у першому циклі, присутні в реакційної суміші наприкінці ПЛР у незначній кількості.

Для здійснення ПЛР необхідно знати послідовність як найменш 17 п.в. з обох боків дослідного фрагменту ДНК. Зазвичай синтезують два дезокешзувдеотида довжиною 20-30 основ, які являють собою кінцеві послідовності фрагменту ДНК, що нас цікавить. Використовуючи комплементарні до цих ділянок олігомери - праймери, запускають ампліфікащю (процес збільшення копій гену). Надлишкову кількість праймерів змішують з геномної ДНК, а потім послідовно здійснюють реакції денатурації, отжига (ренатураціГ) і нарощування ланцюгу (подовження праймера). Теплова денатурація супроводжується розплітанням подвійної спіралі ДНК. При зниженні температури має місце- оіжиг олігонуоеотидів^ тобто здійснюється гібридизація олігонуклеотидних праймерів із своїми комплементарними послідовностями. Ріст ланцюгу праймерів каталізує ДНК-полімерза в присутності дезокшрибонуїшедавдіїрдфосфщів, і в результаті добудовується новий комплементарний ланцюг ДНК.

При повторних циклах теплової денатурації, отжигу і синтезу нові ланцюги ДНК, що створилися, виступають у якості шаблонів (матриць) для праймерів, що вшршкає експоненціальне нарощування ділянки "ДНК? обмеженої праймерами, що входять до складу цих фрагментів. ^

У випадках ампліфікації геномної ДНК з клітин (тканин) хребетних тварин інколи відбувається накопичення фрагментів нез'ясованого походження. Тоді здійснюють серію додаткових ампліфікацію, використовуючи інший набір олішнуклеощдних праймерів.

На перших етапах використовували в ПЛР так звані «фрагменти Кленова» ДНК-полімерази І Е.соїі, які виявилися термолабільними, і після кожного циклу денатурації необхідно було додавати нову порцію ферменту. Крім того, при пониженої температурі отжигу знижувалася специфічність ампліфікації.

Після виділення термостабільних ДНК-полімераз, зокрема, з бактерій Ткегтш йдиаіїсия (Гд^-полімераза) суттєво збільшилася ефективність ПЛР. Тод-полімераза зберігає активність після теплової денатурації ДНК і не виникає необхідності замінювати фермент після кожного циклу. Температурний оптимум реакції складає 70-75°С, що значно підвищує специфічність, кількісний вихід і можливу довжину копій фрагментів ДНК, що амшшфікуються.

Успіх певної ПЛР суттєво залежить від вірного вибору праймерів. Для мінімізації можливості невірного спарування, праймер повинен відповідати деяким вимогам. Його довжина повинна бути 17-30 нуклеотидів при вмісті ОС- пар біля 50%. Чім менший вміст СгС-пар у праймері, тім більша повинна бути його довжина. Необхідно запобігти появі вторинних структур у праймері і більше трьох - чотирьох однакових нуклеотидів підряд. Праймери, що використовуються в одної реакції не повинні мати комплементарні ділянки.

Область використання ПЛР велика і постійно поширюється: діагностика генетичних захворювань; виявлення генетичного матеріалу патогенних мікроорганізмів у клінічних зразках; синтез зондів для гібридизації; створення бібліотек кДНК(копійнихДНК) з малій кількості мРНК; мультиплікація ДНК з метою секвенування; спрямований мутагенез та ін..

 

 

9. Методи конструювання рекомбінантних ДНК.

Конструювання рекомбінантних ДНК. Рекомбінантними вважають ДНК, які створені in vitro при об’єднанні двох або більш фрагментів ДНК, що виділені з різних біологічних джерел. З’єднання фрагментів ДНК у єдину молекулу здійснюється декількома методами в залежності від того, які кінці мають фрагменти ДНК, що зшиваються.

З’єднання фрагментів по однойменним „липкім” кінцям. „Липкі” кінці, що створюються при розщепленні рестриктазами комплементарні один одному і тому між ними відбувається процес спарування за рахунок утворення водневих зв’язків між одноланцюговими ділянками комплементарних нуклеотидів. Однак після цього цілісність подвійної спіралі не відновлюється, оскільки залишаються розриви у фосфодіефірному остові. Для їх відновлення використовують фермент лігазу, яка завершує створення рекомбінантної молекули ДНК.

З’єднання фрагментів з „тупими” кінцями. В цьому випадку реакція лігірування (зшивання) має власні особливості. ДНК-лігаза, що кодується фагом Т4, здатна з’єднувати дволанцюгові фрагменти, але для ефективного перебігу реакції необхідна наявність високої концентрації ДНК і майже в 10 разів більшої концентрації ферменту. Однак, і в цьому випадку ефективність цієї реакції на порядок нижча за ефективність зшивки по „липких” кінцях.

З’єднання фрагментів з різнойменними кінцями. „Липкі” кінці можна ферментативним шляхом з’єднати з молекулою ДНК з „тупими” кінцями. Для цього „затуплюють” „липкі” кінці. Це досягається або відщепленням нуклеотидів „липких” кінців за допомогою ферменту – нуклеази S1, яка руйнує лише одноланцюгову ДНК, або „липкі” кінці добудовують, тобто за допомогою ДНК-полімерази на одноланцюговому „липкому” кінці синтезують другий ланцюг, а потім проводять зшивання фрагментів за допомогою ДНК-лігази.  

Коннекторний метод з’єднання фрагментів ДНК. Суть методу полягає у приєднанні до кінців одного з фрагментів ДНК одноланцюгового полінуклеотиду, наприклад, полі А (dА), а до іншого – комплементарного до нього, наприклад, полі Т (dТ). Фрагменти, що добудовані таким чином потім змішують і обробляють лігазою.

Лінкерний метод з’єднання фрагментів ДНК. В тому випадку коли виникає необхідність клонувати фрагменти ДНК, що отримані при розщепленні одною рестриктазою, у векторі, який має сайт рестрикції для іншої рестриктази, використовують короткі синтетичні дволанцюгові олігонуклеотиди, у складі яких є сайти рестрикції для одної або декількох рестриктаз. Лінкер довжиною 6 – 12 п.н. лігірують по „тупих” кінцях з ДНК-мішенню, потім нову молекулу розрізають за допомогою певної (такої самої, як і у векторі) рестриктази і отримують фрагменти з „липкімі” кінцями, комплементарними до „липких” кінців вектору. З’єднання векторної молекули з ДНК-мішенню здійснюють за допомогою лігази.

Після того, як фрагменти ДНК з’єднані у пробірці, їх необхідно ввести у живі клітини. Для цього використовують спеціальні молекули – вектори.