Вектори, типи векторів, вимоги до векторів.

Введення у клітину і стабільна підтримка генетичної інформації, що міститься у рекомбінантних молекулах ДНК, досягається за допомогою векторних молекул, або векторів. Векторами називають молекули ДНК, які здатні акцептувати (включати в себе) чужорідну ДНК і забезпечувати її реплікацію, експресію і/або трансформацію (переніс у інші організми). Таким чином, вектор дозволяє здійснити введення у клітину додаткової генетичної інформації. В якості векторів використовують, як правило, плазміди, бактеріофаги, мобільні елементи, віруси тварин. В наш час створено значна кількість векторів, які розрізняють за профілем їх використання на декілька типів.

1.    Вектори для клонування. Використовують для ампліфікації (збільшення кількості) шляхом реплікації фрагменту ДНК, що вбудований у такий вектор. Для цього найчастіше використовують бактеріальні плазміди і фаги. Для клонування великих фрагментів геному використовують вектори – штучні бактеріальні і дріжджові хромосоми (ВАС і YАС).

2.    Вектори експресії. Їх використовують для аналізу певних послідовностей генів і білкових продуктів, а також для наробки певного білку. Існує значна кількість систем експресії, особливо для прокаріотичних організмів. Є, також, вектори для експресії генів у клітинах дріжджів, рослин і тварин. Вектори експресії для еукаріот завжди містять промотор, здатний працювати у даному типі організму і сайт поліаденілірування (роlу(А) – хвіст), який складається приблизно з 200 залишків аденозину. Наявність роlу(А)- хвосту дозволяє відокремити матричну - мРНК від рибосомальної – рРНК і транспортної - тРНК, а також надає можливість приєднання олігомерів oligo(dТ), які ініціюють синтез комплементарних ДНК-копій (кДНК) на підставі мРНК за допомогою рестриктази.             

3.    Вектори для трансформації. Використовують для введення чужорідного фрагменту ДНК у геном реципієнту. Як правило, такі вектори містять специфічні послідовності, які сприяють інтеграції у геном.

Сучасні векторні системи в основному бувають поліфункціональні і об’єднують декілька функцій в одному векторі. Часто у складі векторів існує маркерний ген, який після проникнення вектора у клітину надає їй фенотип, який свідчить про наявність у клітині вектору. Тобто бажано щоб вектор мав селективну генетичну ознаку. Такими ознаками буває стійкість до антибіотиків, до іонів важких металів, температурна стійкість.

У цілому до векторних молекул висувають наступні основні вимоги:

1) вектор повинен мати унікальні сайти рестрикції для декількох рестриктаз (в найкращому випадку по одному для кожної), що надає можливість вбудувати в нього фрагмент чужорідної ДНК;

2) вектор повинен володіти певною ємністю і не виключати вбудований фрагмент;

3) вектор повинен бути репліконом, тобто здатним до реплікації, в певних клітинах за рахунок послідовності початку реплікації або власної, або клітини-господаря;

4) вектор повинен містити послідовність маркерного гену, за допомогою якої можливо здійснити селекцію клітин з векторною конструкцією.

12. Трансформація, компетентність клітин, шляхи її підвищення.

Векторні конструкції з чужорідним геном, що отримані, використовують для трансформації бактеріальних клітин спеціальних штамів Е.соІі.

Трансформація – це процес переносу генетичної інформації, при якому ДНК, що виділена з клітини-донору, потрапляє у клітину-реципієнту. Трансформація може відбуватися як хромосомною, так і плазмідною ДНК. Процес, при якому в бактеріальні клітини потрапляє виділена ДНК фага і зумовлює утворення в них зрілих фагових часточок, має назву трансфекція.    

Мікроорганізми не завжди здатні до трансформації. Трансформуються лише компетентні клітини, які здатні адсорбувати і поглинати ДНК. У багатьох бактерій компетентність виникає лише на певному етапі росту культури – в стадії компетентності.

Один з найважливіших етапів генетичної трансформації – це перенесення молекул ДНК через оболонку клітини. На стан компетентності клітин впливають різні фактори зовнішнього середовища. До них належать температура, рН, іони важких металів, осмотичний тиск та ін.

Компетентні клітини відрізняються від некомпетентних зміною властивостей клітинної оболонки. В них знижений поверхневий заряд, підвищена чутливість до осмотичного шоку. Мікроорганізми, в яких відсутня природна компетентність також можуть бути трансформовані. Для цього клітини оброблюють тим чи іншим способом, для ініціації в них здатності до поглинання ДНК. Найбільш поширений метод індукції компетентності у клітин Е.соІі – це обробка крижаним розчином СаСl2. Використовують також спосіб глибокого заморожування з наступним відтаюванням клітин, що забезпечує збільшення проникності для фагової, плазмідної і хромосомної ДНК. Метод має назву кріотрансформація. Для підвищення проникності клітинних мембран на них впливають електричним струмом. Ця процедура називається електропорація. Умови її проведення різні для різних видів бактерій. При роботі з Е.соІі клітинну суспензію і ДНК розміщують в посудині з зануреними електродами і подають поодинокий імпульс струму. Після цього ефективність трансформації покращується до 109 для коротких плазмід (приблизно 3 т.п.н.) і до 106 для великих (приблизно 135 т.п.н.).

13. Плазміди і кон’югація, процес мобілізації плазмід.

Плазміди і кон’югація в бактеріях. Поряд з хромосомною ДНК в бактеріальній клітині може існувати і додатковий генетичний матеріал у вигляді плазмідної ДНК. Плазміди є репликонами і стабільно успадковуються. Як правило, плазміди мають форму кільця побудованого з двох ланцюгів ДНК.

У клітині може міститься від 10 до 200 копій дрібних плазмід, або 1-4 копії великих. Реплікація плазмід в значному ступені залежить від клітини-господаря. Мутації, що порушують реплікацію бактерії, як правило, впливають і на реплікацію плазмід. Ряд плазмід, які містяться у клітинах у незначній кількості – 1-2 копії, мають власну систему реплікації.

Плазміди часто змінюють фенотипові властивості клітин. Це пов’язано з тім, що вони містять детермінанти стійкості до антибіотиків - R-плазміди, до іонів важких металів, або гени біодеградації деяких органічних сполук – D-плазміди. Були виявлені також плазміди, які мали генетичні системи, що детермінують перенесення плазмід в інші клітини внаслідок кон’югації. Таким чином, кон’югація – це процес генетичного обміну, при якому здійснюється переніс генетичної інформації від клітини-донора до клітини-реципієнта при безпосередньому контакті клітин між собою. За здатністю до кон’югативного переносу плазміди поділяються на кон’югативні і некон’югативні. Кон’югативні плазміди містять, так званий фактор фертильності F. Клітини, що містять цей фактор стали називати клітинами F+, а клітини, які не містять цього фактору - клітинами F?. Виявилося, що клітини з фактором F завжди є донорами генетичного матеріалу, а клітини, в яких цей фактор відсутній – реципієнти.

З клітини донора в клітину реципієнту переноситься лише одна нить плазмідної ДНК починаючи з специфічного сайту oriT, де створюється одноланцюговий розрив. Потім відбувається розділення ланцюгів ДНК, яке необхідне для ініціації переносу і комплементарного синтезу ДНК як у клітині-донорі, так і у клітині-реципієнті. Етап, що завершує цей процес, пов’язаний з утворенням кільцевих структур плазмідних ДНК.

 F-плазміди також сприяють переносу в клітини-реципієнти інших, некон’югативних плазмід, цей процес має назву – мобілізація. Таким чином, перенесення некон’югативних плазмід за рахунок кон’югативних – це процес мобілізації. Мобілізація може здійснюватися двома шляхами:

-      по-перше, перенесення некон’югативної плазміди може відбуватися за рахунок специфічних речовин, які синтезуються генами кон’югативної плазміди, що відповідають за переніс. Ці речовини активують специфічні ділянки генів некон’югативної плазміди, які, у власну чергу, створюють умови, при яких відбувається перенесення плазміди в клітину-реципієн.

-      по-друге, некон’югативні плазміди можуть переноситься в клітини-реципієнти поряд з кон’югативними плазмідами у складі коінтегратів. Тобто, коінтеграти – це єдина молекула ДНК, в якій поєднані два, або більш реплікони (плазміди) і кожен з них здатний до незалежної реплікації. У природі частіше зустрічаються коінтеграти між плазмідами-RTF, тобто плазмідами, що детермінують стійкість до тетрацикліну і здатність до кон’югативного переносу, з плазмідами, які містять гени стійкості до декількох антибіотиків, плазмідами-ґ. Поєднання цих плазмід і створення комбінації – RTF – ґ сприяє швидкому розповсюдженню цього коінтеграту у бактеріальному середовищі.

Необхідно відмітити також, що плазміди-F можуть включатися і в бактеріальну хромосому за типом незаконної рекомбінації, тобто на основі обміну негомологічними ділянками ДНК. Хромосоми бактерії, в які включений фактор фертільності F, набувають здатність до переносу в клітини придатного реципієнту. Ця властивість використовується для створення рекомбінантних бактерій.

Однак, необхідно ураховувати, що в клітинах-реципієнтах можуть виникнути перешкоди для чужорідних ДНК.

По-перше, чужорідна ДНК може стати мішенню для ферментів рестрикції.

По-друге, чужорідна ДНК повинна мати власний сайт реплікації, або бути здатною використовувати систему реплікації клітини-реципієнта.

По-третє, чужорідна ДНК повинна бути сумісною з вже існуючими плазмідами.

По-четверте, чужорідна ДНК не повинна порушувати клітинні процеси реципієнта.