Особенности терапии вирусных инфекций.

Противовирусная терапия, в отличие от антибактериальной, обладает значительно меньшим арсеналом лечебных препаратов.Эффективностьмногих противовирусных химических соединений и препаратов установлена в экспериментальных исследованиях и в результате многочисленных клинических испытаний. Однако лишь немногие из них разрешены для широкого практического применения.

По химическому составу и механизму действия противовирусные средства разделяются на три группы:1) химиопрепараты; 2) интерфероны; 3) индукторы интерферонов.

Химиопрепараты. К противовирусным химиопрепаратам относятся аномальные нуклеозиды, производные адамантана, синтетические аминокислоты, аналоги пирофосфата, тиосемикарбазоны и другие вируцид-ные препараты. Средства в большинстве своем эффективны при лечении гриппа и герпетической инфекции. К ним, к сожалению, быстро формируется резистентность, что существенно влияет на результаты лечения.

Интерфероны. Интерфероны (ИНФ) относятся к биологическим противовирусным неспецифическим средствам. Они представлены практически во всех клетках организма и направлены на подавление репликации вирусов, их элиминацию и санацию организма. Механизм противовирусного действия ИНФ связан с блокадой синтеза вирусоспецифических белков путем распознавания и дискриминации информационных РНК.

Препараты ИНФ делятся по составу на альфа-, бета- и гаммаинтерфероны, а по способу получения — на природные человеческие, лейкоцитарные (первого поколения) и рекомбинантные ИНФ (второго поколения).

Со времени появления ИНФ стали вызывать большой интерес с точки зрения как профилактики, так и лечения вирусных заболеваний. Результаты исследований показали, что ИНФ эффективны для лечения вирусных гепатитов, герпеса, острых респираторных инфекций, ВИЧ-инфекции и некоторых других заболеваний

Индукторы интерферона представляют собой весьма разнообразную группу, высоко- и низкомолекулярных природных и синтетических соединений, способных вызвать образование интерферона в организме больного. В настоящее время имеются данные о целесообразности использования в комплексной терапии следующих индукторов интерферона: флуореонов, аналогов госсипола, сополимеров пирана, неовира и др. при

герпетическом заболевании глаз, гриппе, риновирусной инфекции и прочих заболеваниях
18.Действие физических и химических факторов на вирусы.

 Для защиты от воздействия внешних факторов(температуры, излучений (ионизирующего, рентгеновского, ультрафиолетового и светового), ультразвука, давления, рН среды, формалина, гидроксиламина, органических растворителей, фенола и др. ) у вирионов есть белковая оболочка. В зависимости от ее строения и хим состава один и тот же фактор может разрушать одни вирионы полностью, другие частично, а на третьи совершенно не оказывать влияния.

Например, в кислой среде (рН 3,0…6,0) большая группа миксомирусов проявляет значительную устойчивость, а некоторые вирусы из семейства Picornaviridae быстро инактивируются. Такое же явление наблюдают по отношению к органическим растворителям: те вирионы, в оболочках которых нет липидов, устойчивы к этим веществам, а липидосодержащие вирусы быстро разрушаются при их воздействии.

Избирательная чувствительность вирусов к физико-химическим факторам – это свойство, которое передается по наследству.

Инактивация вирусов означает полную или частичную утрату их биологической активности , которая наступает в результате действия физико-химических факторов.
Все агенты химической и физической природы вызывают изменения в оболочке. Характер и степень этих изменений зависят от природы инактивирующего фактора, его дозы, продолжительности действия и от вида вируса.
При инактивации вируса может происходить или расщепление (гидролиз) белков оболочки или коагуляция и уплотнение белков. Расщепление и распад белковой оболочки наблюдают у вирусов при инактивации их в кислой и щелочной среде.
Коагуляция и уплотнение белковой оболочки вирусов происходят при воздействии на них формальдегида, высокой (выше 700С) температуры или фенола. Механизм инактивации вирусов формальдегидом зависит от концентрации и продолжительности воздействия: высокие конц вызывают быструю коагуляцию и уплотнение белков, формальдегид не успевает проникнуть внутрь вириона, и вирусная нуклеиновая кислота сохраняет свою инфекционность. При низких конц идет наруш нукл кислоты и она теряет свои инфек св-ва. Такой же мех-м при воздействии высоких температур, а также раствора карболовой кислоты.

В целях инактивации вирусов были испытаны химические и физические агенты, которые действуют преимущественно на нуклеиновую кислоту: I-пропиолактон, гидроксиламин, УФ, некоторых красителей – действуют на нукл к-ту - сильно повреждают ее - вирус теряет свои инфекционные свойства.
Для уничтожения вирусов используют кипячение, сухой жар, автоклавирование, УФ, растворы фенола, едкого натра, лизола (2…5%), особенно горячие (70…900 С).
К антибиотикам вирусы не чувствительны.

Консервируют с помощью глицерина( пересылка пат материала для диагностич исслед, вирус сохр свои св-ва до года), замораживание( -40гр и ниже сохр от неск месс до неск лет) и высушивание( вирус матер-л замораж, затем в вакууме высушив до неск лет).
19. Механизм и использование в вирусологии ПЦР и ДНК-зондов.

ПЦР. Для вирусологической диагностики этот метод стал одним из главных. ПЦР позволяет выявить в исследуемом патматериале наличие специфического участка ДНК или РНК, характерного для исследуемого организма и многократно разможить его – амплифицировать. Амплификация – изолированное размножение гена или его фрагментов. Этапы:

1. Выделение ДНК. Готовят суспензию, обрабатывают, очищают.

2. Собственно амплификация. При этом изменяют температурный режим, и процесс идет стадийно:

1) Плавление ДНК – 92 градуса – расплетение нитей;2) Отжиг праймеров; 3) Достройка комплементарных цепей

3. Детекция. Учет результатов. Получение окончательного результата проводят с помощью электрофареза, результаты – на мониторе компьютера. Всегда сравнивают полученный результат сравнивают с контрольными положительными и отрицательными контрольными образцами. Выявляют продукт амплификации с помощью ДНК-зондов.

Преимущества: высокая чувствительность, достаточно 10 вирусных частиц; высокая специфичность; быстрота получения результата

Разработан метод ПЦР в реальном времени. Регистриты можно регистрировать в любой момент времени при прохождении этой реакции. Для выявления продуктов амплификации используют флюоресцентные ДНК-зонды. К зонду присоединены 2 химических соединения – флюоресцентная метка и гаситель флюоресценции. В ходе ПЦР происходит разъединение флюоресцентной метки и гасителя. Это приводит к появлению свечения. Регистрируя интенсивность свечения можно узнать о ходе реакции.

ДНК-зонды. С помощью ДНК-зонда можно обнаружить вирусные нуклеиновые кислоты в любом материале от больных животных. Для этой цели пригоден как свежий материал (ткани, смывы, кровь), так и высушенный, мороженный и даже частично разложившийся.

Кратко метод ДНК-зондов сводится к следующему:          

1. Получение одноцепочного фрагмента ДНК определенного вируса (ДНК-зонда) и его метка.

2. Выделение из патологического материала нуклеиновых кислот и их денатурация (расплетение двухцепочных молекул на одноцепочные).

3. Контакт образовавшихся одноцепочных молекул ДНК (или РНК) с ДНК-зондом при 55˚С, приводящий к образованию двухцепочных молекул (молекулярная гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности.

4. Удаление всех негибридизированных одноцепочных молекул нуклеиновых кислот.

5. Обнаружение (по метке) образовавшихся двухцепочных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд.

Достоинства: Высокие чувствительность и специфичность, универсальность, отсутствие необходимости в стерильной работе и математической обработке материалов.

Недостатки: Относительная технологическая сложность, и трудность получения ДНК-зонда
20. Экология вирусов. Особенности эволюции вирусов.

Экология вирусов – раздел вирусологии, изучающий взаимодействия или связи вирусов с окружающей их средой. Вирус и членистоногие –переносчики; Вир и хлоднокровные – резервуар инф-ии, Вир и птицы – транспорт, Вир и млекопит –эти отношения зависят от генетич особ-ей и специф и неспециф иммун-ой защиты.

 Среда обитания вирусов. В клетке происходит активная фаза –репродукция. Организм –механизм взаим вируса и организма. Вн среда- пассивн фаза- неблагоприятн для вируса Дя вирусов характерны индивид, попул-видов ибиоцинотическая орг-ия. Человек выделяет вирусы из природы и создает культуральный вирус, созд-т вакцины.

 ТИПЫ взаим-я кл и вируса 1.Альтернативная вирусная инфекция мб: а) Продуктивная (репликативная) инфекция. Вирус перестраивает метаболизм клетки и заставляет её реплицировать вирусные компоненты. Происходит гибель кл. б) Абортивный тип - не завершается образованием вирусного потомства, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов. Не происходит гибели кл и репродукции вирусов.

Эволюционное происхождение вирусов Гепотезы: 1-вирусы результат морфофункционального регресса, связанного с паразитическим образом жизни (действительно, вирусы представляют собой эталонный вариант облигатного паразитизма)- предки вирусов имели клеточное строение. 2-происхождение вирусов из доклеточных организмов- предшественники вирусов еще тогда избрали паразитический образ жизни, и, таким образом, они являются наиболее древними паразитами.3-гипотеза об эндогенном происхождении вирусов- вирусы это фрагмент когда-то клеточной нуклеиновой кислоты, который приспособился к сепаративной репликации. 4- «космическая» гипотеза, вирусы занесены из космоса. Особенности эволюции вирусов на современном этапе.Эволюция вирусов в эру научно-технического прогресса в результате мощного давления факторов(применение пестицидов, антибиотиков, вакцин и других биопрепаратов, огромная концентрация населения в городах, развитие современных транспортных средств и тд)протекает значительно быстрее -приводит к возникновению неизвестных ранее возбудителей, изменение свойств и путей циркуляций известных ранее вирусов, а также к значительным изменениям восприимчивости и сопротивляемости человеческих популяций.
21. Санитарная вирусология. Предмет, задачи, методы индикации вирусов в окружающей среде.

 • Изучает те же вирусы, что и медицинская вирусология, но не в организме человека, а объектах внешней среды (почва, вода, воздух, предметы обихода, пищевые продукты) и способных непосредственно или косвенно оказывать неблагоприятное воздействие на здоровье человека и животных..

Задачи • Изучение патогенных для человека вирусов в объектах внешней среды (ВС) • Разработка методов индикации и идентификации вирусов в объектах ВС. • Изучение устойчивости вирусов к обеззараживающим факторам для оценки эффективности методов освобождения объектов ВС от вирусов. • Разработка системы профилактических мер по оздоровлению объектов ВС от вирусного загрязнения. Разработка гигиенических регламентов, оценивающих качество и обеспечивающих эпидемиологическую безопасность объектов ВС в отношении вирусов. • Создание сети санитарно-вирусологических лабораторий при центрах гигиены и эпидемиологии, подготовка кадров.

Определение вирусов в ВС. • Методы санитарной вирусологии разработаны на основе классических вирусологических методов с учетом специфики исследования.

При санитарно-вирусологическом контроле объектов ВС используется комплекс вирусологических, биологических, серологических и молекулярно-генетических методов.

Вирусологический метод • Заключается в выделении вирусов (чаще всего в культурах клеток) с последующей их индикацией и идентификацией.

Серологический метод • Заключается в обнаружении вирусных антигенов в серологических реакциях (чаще всего с помощью ИФА)

Молекулярно-генетический метод • заключается в обнаружении нуклеиновой кислоты вирусов с помощью ПЦР и ИКК-ПЦР (интегрированной с культурой клеток)

Исследование объектов ВС на вирусное загрязнение проводят: • - в плановом порядке (текущий контроль); • - в период эпидемиологического риска; • - экстренный; • - по санитарно-эпидемиологическим показаниям.

В качестве санитарно-показательных агентов при оценке воды, почвы и пищевых продуктов по вирусологическим показателям чаще всего выступают ЭНТЕРОВИРУСЫ.
1. GMP - система производства и качества лекарственных средств.

Стандарт GMP – система норм, правил, указаний в отношении производства ЛС, медицинских устройств, изделий диагностического назначения , продуктов писания, пищевых добавок.

- Основные концепции GMP:

=контроль всей документации

=контроль за соблюдением правил

- Основные разделы:

1. Терминология

2. Обеспечение качества

3. Персонал предприятия

4. Соответствующие здания и помещения

5. Технологическое оборудование

6. Процесс производства

7. Контроль качества

8. Валидация

Терминология: даются основные ключевые понятия, использующиеся в документации

Обеспечение качества: укомплектованность персонала; наличие сотрудников, ответственных за за качество продукции, регистрация этапов производства, определяется порядок возврата продукции при нарушении качества; выяснение причин нарушения качества.

Персонал предприятия: укомплектованность квалифицированного персонала для руководителя; четкое распределение функций руководящих работников; порядок подготовки персонала; обеспеченность технологической одеждой; перечисляется инструкция для персонала( должностная)

Соответствующие здания и помещения : соответствие помещения оборудованию: чистые производственные помещения по системам вентиляции, изоляции, чистоты.

Технологическое оборудование: оборудование с цеха ферментации; для цеха химической очистки обор-е дол быть адекватно технологич процессам; контрольно-измерительные приборы изменяются с учетом графика.

Процесс производства: должен проводится по регламенту: пошаговая инструкция + внимание исходному сырью (документы, усл хранения, контроль на входе), проверка на микробную контаминацию + постадийный контроль процесса, который документативно ведется, проверка санитарного состояния и рабочих мест, документы проверки хранятся не менее года после выхода срока годности

Контроль качества: контролирует сырье, полупродукты и готовый продукт, и хранит образцы производства каждой серии не менее 3 лет

Процесс документированного подтверждения и оценки соответствий производственного процессаи качества продукта уствновленным требованием. Позволяет получить о соответствии тех процессоврегламенту. Она завершается составлением отчета:

- периодическая (постоянно)

- внеплановая (при ЧС, при изменении технологии)
2. Основные направления и методы биотехнологии

Биотехнология — это производство необходимых человеку продуктов и биологически активных соединений с помощью живых организмов, культивируемых клеток и биологических процессов.

Основными направлениями биотехнологии являются: 1) производство с помощью микроорганизмов и культивируемых эукариотических клеток биологически активных соединений (ферментов, витаминов, гормонов), лекарственных препаратов (антибиотиков, вакцин, сывороток, высокоспецифичных антител и др.), а также ценных соединений (кормовых добавок, например незаменимых аминокислот, кормовых белков; 2) использование биологических методов борьбы с загрязнением окружающей среды (биологическая очистка сточных вод, загрязнений почвы) и защита растений от вредителей и болезней; 3) создание новых полезных штаммов микроорганизмов, сортов растений, пород животных и т.п.

Одними из самых важных методом современной биотехнологии являются клеточная и генная инженерия, а также клонирование.

1. Клеточная инженерия – это отрасль биотехнологии, в которой применяют методы выделения клеток из организма и переноса их на искусственные питательные среды, где эти клетки продолжают жить и размножаться. Методы клеточной инженерии направлены на конструирование клеток нового типа. Они могут быть использованы для воссоздания жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток, для объединения целых клеток, принадлежавших различным видам с образованием клетки, несущей генетический материал обеих исходных клеток, и других операций.

1. Генная инженерия — искусственное, целенаправленное изменение генотипа микроорганизмов с целью получения культур с заранее заданными свойствами. Основной метод генной инженерии — выделение необходимых генов, их клонирование и введение в новую генетическую среду. В конце 90-х годов XX века США вплотную подошли к получению животных методом клонирования клеток эмбрионов, хотя здесь еще нужны дальнейшие серьезные исследования.

2. клонирование. Благодаря этому методу мы получаем идентичные организмы путем бесполого размножения.
3 Этапы биотехнологического производства. Методы ферментации.

 

Существует 5 стадий биотехнологического производства.

Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически действующего начала. Они состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата данного типа, ферментного или иммобилизованного. При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами.

Третья стадия - стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит.

На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.

Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии расфасовки и укупорки, так должны быть стерильными. Далее приводится характеристики каждой из стадий промышленного микробиологического синтеза.

Методы ферментации

Стадия ферментации – биосинтеза- является основной стадией в биотехнологическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов (биомасс, эндо- и экзопродуктов).

Эта стадия осуществляется в биохимическом реакторе (ферментере) и может быть организована в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта различными способами. Ферментация может проходить в строго асептических условиях и без соблюдения правил стерильности (так называемая «незащищенная» ферментация); на жидких и на твердых средах; анаэробно и аэробно. Аэробная ферментация, в свою очередь, может протекать поверхностно или глубинно (во всей толще питательной среды).

Технологическое оборудование для промышленного производства. Применение, требования.

Технологическое оборудование должно обеспечивать соответствие выпускаемого продукта установленным требованиям, в том числе по следующим параметрам:
- однородности;
- размерам;
- массе;
- чистоте и другим параметрам.

Рекомендуется проводить непрерывный контроль основных параметров оборудования (при необходимости по верхнему и нижнему пределам), а также предусматривать диагностику при отказе оборудования. По возможности целесообразно предусматривать работу оборудования без присутствия оператора.

Рекомендуется проводить контроль следующих узлов и параметров:
- работы основного двигателя;
- герметичности рабочей зоны;
- положения окон оборудования и панелей в закрытом состоянии;
- скорости подачи исходного материала;
- уровня материала в исходном загрузочном бункере;
- работу системы мойки оборудования WIP -"Wash-ln-Place" (мойка на месте таблеточных прессов, обеспыливателей и пр.);
- давления сжатого воздуха.

Аттестация (испытания) оборудования проводится, как правило, в три этапа (см. ГОСТ Р 52537):
- в построенном (установленном) состоянии;
- в оснащенном состоянии;
- в эксплуатируемом состоянии.
Методика аттестации (испытаний) включает в себя:
- перечень работ в порядке их выполнения;
- технологию выполнения каждой работы (при необходимости);
- применяемые приборы, материалы и пр.;
- допустимые значения параметров;
- формы протоколов (актов) испытаний;
- требования к исполнителям.

4. Методы производства аминокислот, ферментов, гормонов

 

Производство аминокислот

Аминокислоты получают путем химического синтеза или экстракцией из белковыхгидролизатов.

Способы пр-ва амин.к-т:

1) Гидролиз белоксодержащего сырья.

2) Химический синтез.

3) Микробиологичекий синтез.

4) Биотрансформация предшественников амин.кислот (хим. - микробиологический синтез).

При гидролизе белоксодержащее сырье (отходы пищевой и молочной промышленности) нагревают с растворами кислот или щелочей при 100-105°C в течение 20-48 ч. Чаще всего используют 20% р-р HCl. Минусы – частичное разрушение некоторых амин.кислот. Хим. синтез - высокопродуктивные процессы, позволяющие с высоким выходом производить отдельные амин.кислоты. Существенный минус – получение целевых продуктов в виде рацемической смеси D- и L-изомеров. Все шире применяется биотрансформация предшественников амин.кислот, предварительно полученных хим. путем, с помощью иммобил-ых клеток микроорганизмов или выделенных из них ферментов.

6. Методы производства антибиотиков

Общая характеристика. Любые а/б применяются не менее 5 дней

Классификация антибиотиков по штамм-продуцентам:

1. Образуемые эубактериями: бактерии рода bacillus , бактерии рода Pseudomonas/

2. Образуемые бактериями рода Streptomyces

3. Образуемые несовершенными грибами.

4. Образуемые грибами клеток базидио и аксомицетов

5. Образуемые лишайниками, водорослями, низшими растениями

6. Образуемые высшими растениями

7. Образующиеся в органах животных: лизоцим, интерферон

Первичные метаболиты – вещества необходимые для роста клеток (витамины)

Вторичные – антибиотики – факторы защиты

Антибиотики, продуцируемые высшими растениями – фантоциды