На среде Клауберга                                                   На среде Тинсдаля

    на среде Бучина

Из колоний материал пересевают на свёрнутую лошадиную сыворотку (среда Ру) для выделения чистой культуры

Идентификация чистой культуры:

• по биохимическим свойствам:

1. ферментируют глюкозу и мальтозу до кислоты, не ферементируют сахарозу

2. не выделяют уреазу (проба Закса отрицательная)

3. выделяют цистиназу (проба Пизу положительная)

• по антигенным свойствам (РА)

• определение токсигенности – РП в геле

 

Проба Пизу (на цистиназу)

• Среда для определения цистиназы (для пробы Пизу) (посев производят уколом):

– МПА, 1% раствор цистина, 10% раствор ацетата свинца, лошадиная сыворотка

• При выделении цистиназы цистин расщепляется с выделением H₂S и происходит почернение среды по ходу посева

• Для возбудителя дифтерии эта проба положительная!!!

 

Проба Закса (на уреазу)

• Среда для определения уреазы (для пробы Закса):

– Вода, мочевина, раствор фенолового красного, фосфат калия

• При наличии уреазы мочевина расщепляется с образованием аммиака и среда краснеет.

• Для возбудителя дифтерии эта проба отрицательная!!!

 

4.Серологический метод

Для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета проводят определение уровня антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови человека в РПГА.

 РПГА используется эритроцитарный диагностикум, который представляет собой эритроциты с адсорбированным на них дифтерийным анатоксином

Условно-защитный титр – 1:40 (антитоксический иммунитет напряженный); если титр меньше – требуется ревакцинация.

Специфическая профилактика дифтерии

В соответствии с календарем прививок: детей вакцинируют с 3 месяцев жизни 3-кратно с интервалом 1,5 месяца вакциной АКДС. Первая ревакцинация проводится в 18 месяцев вакциной АКДС. Вторая ревакцинация проводится в 6 – 7 лет, третья ревакцинация – в 14 лет вакциной АДС – М. Последующие ревакцинации проводят каждые 10 лет ассоциированными препаратами (АДС или АДС-М) или монопрепаратами (АД-М).

Существуют также вакцина Тетракок и Инфанрикс.

Специфическое лечение дифтерии

· Противодифтерийная лошадиная сыворотка содержит специфические АТ сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным анатоксином; очищенная и концентрированная методом “Диаферм-3”. Вводится по Безредке.

· Иммуноглобулин противодифтерийный человека для внутривенного введения содержит иммуноглобулины сыворотки крови доноров, иммунизированных дифтерийным анатоксином; фракция выделена по методу Кона.

 

88. Микобактерии туберкулеза

· Туберкулез– инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое микобактериями.
Специфическая гранулема (туберкулема) – очаг хронического воспаления, выглядит как небольшой бугорок, характерный патоморфологический признак туберкулеза.
Туберкулёз вызывают Mycobacterium tuberculosis (90%), bovis(5%), africanum(3 %)

· Классификация:
21 группа по определителю Берджи, Грамположительные неспорообразующие палочки) род Mycobacterium. Выделяют 3 подгруппы:
1) Не растущие на питательных средах – M.leprae (возбудитель лепры)
2) Медленнорастущие – безусловно-патогенные (M.tuberculosis, bovis, africanum), условно-патогенные (M. Srofulaceum, kansasii, xenopi – возбудителои микобактериозов) и патогенные для животных (M.paratuberculosis)
3) Быстрорастущие – непатогенные или условно-патогенные

· Морфологические и тинкториальные свойства
Прямые или слегка изогнутые палочки, грамположительные, не имеют жгутиков (неподвижны), спор и капсул не образуют, устойчивы к кислотам, щелочам, спирту, гидрофобны, в культурах встречаются зернистые формы, ветвящиеся, возможен переход в фильтрующиеся и L-формы.

· Культуральные свойства:
Питательные среды должны содержать глицерин, яйца, витамины, соли и тд. На среде Левенштейна-Йенсена образуют сухие, неровные колонии, на среде Сотона – образуют нежную плёнку, которая утолщается и падает на дно.

· Биохимические свойства:

Биохимический признак	M. tuberculosis	M. bovis	Другие микобактерии
Образование никотиновой кислоты	Да	Нет	Да/Нет
Восстановление нитратов в нитриты	Да	Нет	Да/Нет
Потеря каталазной активности при нагревании до 68°С	Да	Да	Нет

· Токсигигенные свойства – нет эндотоксина, не секретируют экзотоксин

· АГ-свойства – протеины, полисахариды, липиды общие и спецефические АГ, Корд-фактор (разрушает митохондрии)

· Резистентность – хорошо сохраняются в мокроте, на предметах(больше 3 месяцев), в почве(6 месяцев), воде(больше года) и молочных продуктах. Устойчивы к дезинфицирующим веществам, антибиотикам. Погибают при кипячении и под действием солнечного света.

· Патогенез и эпидемиология
Источник инфекции- больной человек или животное. Возбудители обитают в организме человека и животных. При активно протекающей болезни могут выделятся в окружающую среду.

· Механизмы и пути заражения
Воздушно-капельный (возбудители способны принкать через верхние дыхательные пути, а ткже чрез слизистые оболочки ЖКТ и повреждённую кожу)

· Формы туберкулёза - выделяют легочную и внелегочные формы(тубик кожи, костей суставов и тд)

· Патогенез
Сначала возникает инфекционная гранулёма в зоне проникновения и размножения микобактерий, далее воспалительный процесс переносится на регионарные лимфотические узлы, после чего возникает первичный туберкулёзный комплекс – сенсибилизация организма (повышение чувствительности к раздражителю)
Первичный очаг (гранулёма) может рассасываться. В нём и лимфоузлах микобактерии могут сохранятся долгие годы, и при неблагоприятных условиях высока вероятность наступления генерализации воспалительного процесса. Поражённый участок кальцинируется и подвергается рубцеванию

· Иммунитет
На фоне первичного инфицирования организма микобактериями формируется нестерильный иммунитет
Постинфекционный и поствакцинальный иммунитет ненапряженный
В формировании иммунитета важное значение имеет аллергия.

· Лаб.диагностика:
1) Исследуемый материал – мокрота, гной, моча)
2) Методы диагностики:
  1. Экспресс-диагностика – ПЦР
 2. Микроскопический метод - окраска нативного исследуемого материала по Цилю-Нильсену (окраска клеточной стенки у возбудителей туберкулёза и лепры в красный), окраска люминисцирующими красителями.
3.Бактериологический метод
I этап: посев обогащенного исследуемого материала, предварительно обработанного кислотой и нейтрализованного щелочью на питательные среды - среда Сотона, Левенштейна-Йенсена, Финна, среда «Новая».
В среды Сотона и Левенштейна-Йенмена добавляют малахитовую зелень, чтобы не росла лишняя микрофлора.
Для M.tuberculosis первый учёт роста через 14-25 дней, для M.bovis – 24-40 дней(при t=37гр)

· II этап: изучение выросших колоний по культуральным, морфологическим (наличие корд-фактора) и тинкториальным свойствам. Посев на скошенный агар не нужен тк все лишние бактерии померли при обработке кислотой (микобактерии – кислотоустойчивы!)

· III этап: идентификация чистой культуры по биохимическим свойствам
Тест на каталазную активность (позволяет отличить M. tuberculosis и M. bovis от других микобактерий – нагрев культуры до 68гр ведёт к потере каталазной активности этими бактериями)
Ниациновая проба (ниациновый тест, проба Кона) (позволяет отличить M. tuberculosis от M. Bovis – туберкулёзиз способны синтезировать никотин, поэтому в среде Сотона при добавлении хлорамина и цианистого калия, среда окрашивается в жёлтый)
Восстанавление нитратов в нитриты (позволяет отличить M. tuberculosis от M. Bovis – бовис восстанавливает, туберкулёзис неть)

· 4.Биологический метод:
Производят заражение лабораторных животных исследуемым материалом от больного(К M. tuberculosis чувствительны морские свинки, К M. bovis - кролики) Учет через 3-4 месяца

· 5. Метод кожно-аллергических проб
Проба Манту (в основе лежит гиперчувствительность замедленного типа(ГЗТ) – антителнезависимая). Проводится внутрикожно с аллергеном (туберкулин). Туберкулин – очищенный белок из микобактерий туберкулеза –Диаскинтест. Учет через 72 часа. Различают отрицательную(меньше 5 мм), нормэргическую (5 – 16 мм) и гиперэргическую(более 17мм) реакцию.

· 6. Ускоренный метод диагностики
Метод Прайса ( метод микрокультур ). На стекло наносится обогащенный исследуемый материал, предварительно обработанный кислотой и нейтрализованный щелочью, вертикально погружается в цитратную кровь на 10 - 14 дней, затем сушится, фиксируется, окрашивается по Цилю-Нильсену. В иммерсионный микроскоп видны микобактерии в виде кос или нитей войлока, благодаря наличию у патогенных микобактерий корд-фактора.

· Специфическая профилактика и лечение
Вакцины БЦЖ и БЦЖ-М – содержат живые микобактерии аттенуированного штамма, полученного длительным пассированием возбудителя туберкулеза бычьего типа на картофельно-глицериновой среде с добавлением желчи, используют с профилактической целью (внутрикожно) для создания иммунитета с ГЗТ в плановом порядке.
В РФ вакцинируются все новорожденные на 5 – 7 день жизни; ревакцинация проводится только детям с отрицательной туберкулиновой пробой в 6 – 7 лет и в 14 – 15 лет.

·

89. Трепонемы. Лептоспиры. Боррелии. Классификация. Свойства. Заболевания, вызываемые ими. Эпидемиология и патогенез. Иммунитет. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика и лечение.

1 Группа по Берджи – СПИРОХЕТЫ

• Семейство - Spirochaetaceae

• Основные роды патогенные для человека:

◼ Treponema

▫ виды:

Т. pallidum подвид pallidum

Т. pallidum подвид pertenue

Т. pallidum подвид carateum

◼ Borrelia

▫ виды:

B. recurrentis

B. duttoni

B. hispanica

B. burgdorferi и др.

◼ Leptospira

▫ вид – L. interrogans

Сифилис – хроническая венерическая болезнь, характеризующаяся поражением кожи, слизистых оболочек, внутренних органов, костей и нервной системы, отличается волнообразным течением со сменой периодов обострения скрытыми периодами.

Морф св-ва

■ тонкие спиралевидные

■  капсулы нет

■  спор не образуют

■  снаружи покрыта чехлом под которым находятся трёхслойная наружная стенка, цитоплазматическая мембрана

■  подвижны: имеет микрофибриллы расположенные между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной, прикрепленные на полюсах к блефаропластам и способствующие движению

Эпидемиология сифилиса

• Источник инфекции – больные первичным и вторичным сифилисом 

• Пути передачи:

◼ половой

◼ контактно-бытовой (редко)

◼ трансплацентарный

◼ трансфузионный 

• Восприимчивый коллектив – любой человек

Патогенез и клиника сифилиса

Твердый шанкр - округлой формы эрозия или язва с ровными, полого опускающимися к центру краями, окруженная нормальной невоспаленной кожей или слизистой оболочкой. Цвет твердого шанкра ярко-красный (цвет свежего мяса). Поверхность его чаще гладкая, блестящая от накапливающегося экссудата, в котором содержится много бледных трепонем. При пальпации шанкр, как правило, безболезненный. При этом в его основании определяется плотноэластический инфильтрат, который по плотности напоминает хрящ ушной раковины, что нашло отражение в названии «твердый шанкр». Средний диаметр его около 1 см.

Периоды сифилиса

• инкубационный период (3 – 4 недели)

• первичный (6 – 8 недель):

◼ серонегативный

◼ серопозитивный

• вторичный (3 – 4 года):

◼ свежий

◼ скрытый

◼ рецидивный

• третичный период (многие годы)

• поздний сифилис:

◼ висцеросифилис,

◼ нейросифилис: спинная сухотка, прогрессивный паралич

Лабораторная диагностика

Исследуемый материал: отделяемое шанкра, пунктат лимфатических узлов, содержимое вторичных сифилидов, кровь

Методы диагностики:

1. Экспресс – диагностика

◼ РИФ

◼ ИФА

◼ ПЦР

2. Микроскопический метод

• Окраска по Романовскому-Гимзе

• Метод тёмнопольной микроскопии для выявления подвижных трепонем

3. Серологический метод

       Все лабораторные серологические тесты можно разделить на две группы:

• нетрепонемные тесты:

◼ реакция микропреципитации (РМП) на стекле с кардиолипиновым АГ (экстракт липидов из бычьего сердца)

◼ РСК (реакция Вассермана) с двумя антигенами - ультраозвученным трепонемным (штамм Рейтера) и кардиолипиновым – с 2006 года не используется

• трепонемные тесты:

◼ ИФА

◼ РПГА

◼ нРИФ

◼ РИТ

• Для уточнения и исключения ложноположительного результата ИФА следует применять иммуноблот (western blot), предназначенный для обнаружения антител класса IgG к отдельным высокоспецифичным белкам микроба.

• Для постановки ИБ используют нитроцеллюлозные полоски, на которые методом электрофореза перенесены белки микроба в порядке нарастания их молекулярных масс. Антитела исследуемых сывороток взаимодействуют с белками в определенных зонах полоски. Дальнейший ход реакции не отличается от такового для ИФА, то есть предусматривает обработку полоски АТ с ферментной меткой и хромоген-субстратом с отмыванием несвязавшихся компонентов.

• Используют наборы реагентов для определения антител классов IgG, содержащие электрофоретически разделенные антигены Tr. pallidum: p15, p17, p45 и p47.

Реакция иммобилизации трепонем (РИТ) основана на способности антител в присутствии комплемента прекращать движение трепонем. Трепонемы получают из яичка кролика, зараженного бледной трепонемой (штамм Никольса). Для постановки реакции смешивают живые трепонемы с сывороткой пациента и комплементом, инкубируют 18-20 часов. Для контроля используют инактивированный комплемент. После инкубации готовят препарат “раздавленная капля” и при микроскопии в темном поле подсчитывают число подвижных и неподвижных трепонем в опыте и контроле.

По формуле определяют процент иммобилизации и оценивают результат:

                                          Тк - То

                      Х = ------------------------------- х 100 %,

                                                  Тк

Тк - число подвижных трепонем в контроле (с инактивированным комплементом);

       То - число подвижных трепонем в опыте (с активным комплементом).

       Результат реакции считается:

       положительным, если процент иммобилизации выше 50,

       слабо-положительным - от 31 до 50,

       сомнительным - от 21 до 30,

       отрицательным - ниже 20.

Иммунитет

■ При сифилисе имеет место гуморальный и клеточный иммунный ответ

■ Образующиеся антитела не обладают протективными свойствами 

Специфическая профилактика

■ вакцинопрофилактика не разработана

■ лечение проводится антибиотиками

■ чувствительны к пенициллину

Лептоспироз (болезнь Васильева-Вейля, покосно-луговая лихорадка, водная лихорадка)

Лептоспира-лепто(тонкий),спира(крючок)

Возбудитель – L. interrogans:

◼  38 серогрупп:

◼ L. pomona

◼ L. hebdomadis

◼ L. grippotyphosa

◼ L. icterohaemarrhagiae

◼ L. canicola и др.

 более 200 сероваров

Морфология

• Спирохета

• Очень тонкая

• Закругленные концы

• Спиралевидный крючок

Тинкториальные свойства

• Грамотрицательные

• Плохо окрашиваются

• анилиновыми красителями

• Используется темнопольная микроскопия

Культуральные свойства

• На плотных питательных средах не растут

• Жидкие сывороточные и синтетические питательные среды

• Растут медленно

• Психрофилы / мезофилы (28-35^оС)

• рН 7,2-7,4

Биохимические свойства

• Не обладают сахаролитической активностью

• Не обладают протеолитической активностью

• Ферменты патогенности: фибринолизин, плазмокоагулаза, липаза и др.

Токсигенные свойства

• Содержат эндотоксин (ЛПС) – пирогенное, кожно-некротическое и летальное свойства

• Продуцируют экзотоксиноподобные вещества (экстрацеллюлярная субстанция) – цитотоксические и гемолитические свойства

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ

• Быстро погибают при высушивании

• Чувствительны к солнечным лучам

• Чувствительны к дезинфицирующим растворам

• Чувствительны к высокой температуре

• 55^оС – погибают через 25-З0 минут

• 76-96^оС – погибают мгновенно

• Хорошо переносят низкие температуры

• В открытых водоемах и влажной почве от 2 недель до 3 месяцев

• В холодной воде до 4 месяцев

• -15^оС несколько месяцев

• На продуктах питания от нескольких часов до 30 дней

• Чувствительны ко многим антибиотикам

Эпидемиология лептоспироза

Источник инфекции – дикие и синантропные грызуны, домашние и промысловые животные. Самый распространённый зооноз в мире.

Пути передачи:

• Водный

• Контактный

• Пищевой

Восприимчивый коллектив – любой человек без специфического иммунитета. Профессиональные группы риска.

Заражение человека

• Купание в открытых пресноводных водоемах

• Питье воды из открытых водоемов и колодцев

• Употребление инфицированных продуктов

• Прямой контакт с больными животными