Получение безвирусного материала. Понятие генной инженерии.

Генная инженерия — совокупность методик, позволяющих выделять нужный ген из генома одного организма и вводить его в геном другого организма. Растения и животные, в геном которых внедрены «чужие» гены, называются трансгенными, бактерии и грибы — трансформированными. Традиционным объектом генной инженерии является кишечная палочка, бактерия, живущая в кишечнике человека. Именно с ее помощью получают гормон роста — соматотропин, гормон инсулин, который раньше получали из поджелудочных желез коров и свиней, белок интерферон, помогающий справиться с вирусной инфекцией.

Процесс создания трансформированных бактерий включает в себя следующие этапы.

Рестрикция — «вырезание» нужных генов. Проводится с помощью специальных «генетических ножниц», ферментов — рестриктаз.

Создание вектора — специальной генетической конструкции, в составе которой намеченный ген будет внедрен в геном другой клетки. Основой для создания вектора являются плазмиды. Ген вшивают в плазмиду с помощью другой группы ферментов — лигаз. Вектор должен содержать все необходимое для управления работой этого гена — промотор, терминатор, ген-оператор и ген-регулятор, а также маркерные гены, которые придают клетке-реципиенту новые свойства, позволяющие отличить эту клетку от исходных клеток.

Трансформация — внедрение вектора в бактерию.

Скрининг — отбор тех бактерий, в которых внедренные гены успешно работают.

Клонирование трансформированных бактерий.

Эукариотические гены, в отличие от прокариотических, имеют мозаичное строение (экзоны, интроны). В бактериальных клетках отсутствует процессинг, а трансляция во времени и пространстве не отделена от транскрипции. В связи с этим для пересадки эффективнее использовать искусственно синтезированные гены. Матрицей для такого синтеза является иРНК. С помощью фермента обратная транскриптаза на этой иРНК сперва синтезируется цепь ДНК. Затем на ней с помощью ДНК-полимеразы достраивается вторая цепь.

Небольшой размер экспланта, применяемый для клонального микроразмножения, поверхностная стерилизация его, асептический перенос на питательную среду и субкультивирование в условиях, исключающих инфицирование, приводят к оздоровлению полученных растений от нематод, грибных и бактериальных патогенов. Этого недостаточно доя оздоровления созданного клональным микроразмножением посадочного материала от вирусов, вироидов, микоплазм. Но именно вирусные болезни - причина потери от 10 до 50% урожая сельскохозяйственных культур, размножающихся вегетативно. Выяснено, что соя и многие другие важные бобовые растения передают вирусы потомству и при семенном размножении, т.е. сорта постепенно отягощаются грузом вирусных инфекций.

Получение безвирусного посадочного материала.Вирусные болезни – причина потери от 10 до 50 % урожая сельскохозяйственных культур, размножающихся вегетативно. Установлено, что соя и некоторые другие важные бобовые растения передают вирусы потомству даже при семенном размножении, в результате чего сорта постепенно отягощаются грузом вирусных инфекций. Наиболее эффективный для оздоровления от вирусов, вироидов и микроплазм способ – культивирование меристем стебля или органов стеблевого происхождения.

 В основе используемого на практике явления лежит специфика строения точки роста растений. Дистальная ее часть, представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет средний диаметр до 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм.

Размеры меристемных эксплантов, используемых для получения безвирусных растений, могут значительно различаться. Предпочтительно использовать предельно малый размер эксплантатттт (0,075–0,1 мм) и разработать оптимальные условия для получения жизнеспособных пробирочных растений. Если это невозможно, то рекомендуется дополнять культуру меристем термо- и хемотерапией. В этом случае предварительная обработка исходных растений сухим горячим воздухом или химическими агентами позволяет добиться оздоровления от вирусов при использовании меристемных эксплантов размером 0,3–0,8 мм.

Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные термокамеры, где в течение первой недели повышают температуру до 37 °С путем ежедневного ее увеличения на 2 °С. Продолжительность термотерапии всецело зависит от особенностей вирусов и их термочувствительности. Если, например, для получения безвирусной гвоздики достаточно 12- недельного воздействия теплом, то для освобождения хризантемы от Б-вируса этот период более продолжителен. Помимо эффекта термотерапии, выявлено положительное воздействие высоких температур на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, хризантемы, фрезии) в условиях in vitro. Термотерапия позволяет увеличить коэффициент их размножения на 50-60%, повысить адаптацию пробирочных высокий процент безвирусных маточных растений.

Оздоровленные применением меристемной культуры растения размножают далее обычными методами клонального микроразмножения. Важное место в этой работе принадлежит диагностике зараженных растений. Наиболее часто применяются методы ИФА и ПЦР.

Этапы получения пробирочных растений картофеля Питательная среда Посадка апикальной меристемы Проросток из меристемы Пробирочное растение из меристемы Пробирочное растение из меристемы после черенкования

 Этапы получения безвирусного картофеля Рост меристемы картофеля в пробирке Ростки картофеля перед вычленением меристемы Черенкование побегов картофеля Растения картофеля перед высадкой в открытый грунт Растения картофеля в открытом грунте Растения картофеля in vitro