Согласованность проводимых измерений/тестов.

(капа - статистика)

При исследовании болезней дикой птицы важно знать о согласованности результатов стандартных тестов, разработанных ранее, и новых, применяемых при эпизоотологических, клинических, патологоанатомических, серологических и других биологических тестах.

Например: В районе «А», в апреле, популяция одного из видов уток составляла 1800 голов; после заболевания 180 и гибели из них 100, а также дальнейшего перелёта 1100 голов в смежный регион в мае осталось около 600, которые были тестированы на наличие антител, например, к ортомиксовирусу подтипа Н₅N₁. Были отобраны 60 проб сывороток крови и исследованы методами РН (стандартный), ИФА и РЗГА. Выборка (n) составила 10% (60 проб сывороток крови).

Таблица 7

Согласованность результатов серологических методов РН и ИФА при обнаружении специфических антител к ортомиксовирусу.

РН	Результат	РН		Всего	p	ИФА		Всего	р
		«+»	«-»			«+»	«-»
	«+»	10	5	15	0,25	12	3	15	0,25
	«-»	5	40	45	-	10	35	45	-
Всего		15	45	60	0,25	22	38	60	0,37

Примечание: РЗГА показана далее по тексту (решение 2).

Решение 1.

пункт I. Превалентность (p) РН– 15/60=0,25; p ИФА – 15/60=0,25

пункт II. (10+40)/60=0,83, (0,83*100=83%)

пункт III. 0,25*0,25=0,062, далее (1,0-p)

пункт IV. 0,75*0,75=0,562

пункт V. 0,062*0,562=0,034

пункт VI. 0,83-0,034=0,796

пункт VII. 1,0-0,034=0,966

пункт VIII. 0,796/0,966=0,82, т.е. капа-статистика оказалась выше умеренного уровня согласованности (0,41 – 0,60) и близка к абсолютной согласованности – 83% (пункт II).

Решение 2. РЗГА тоже представляется возможным определить на согласованность со стандартным методом(РН).

пункт I. Превалентность (p) РЗГА=22/60=0,37

пункт II. (12+35)/60=0,78, (0,78*100=78%)

следующие пункты (III - VIII) решения 2 показали капа - статистику – 0,77, что выше 0,60 – верхней границы умеренной согласованности.

Выводы. С учетом положительной превалентности тестов: РН – 0,25, МФА – 0,25 и РЗГА – 0,37 в первом случае оба теста (РН+МФА) оказались позитивными для 16,6% животных, во втором – 20% (РН+РЗГА). Таким образом, все методы в сочетании могут быть использованы для выявления антител, но не напряженности иммунитета, т.е. устойчивости популяции к реинфекции. Возможность повторного заболевания определяют в экспериментальных условиях, где можно выявить и определить:

- наличие специфических антител к возбудителю в градиенте времени, используя вышеуказанные серологические тесты;

- дозу возбудителя для инфицирования, заболевания, развития признаков болезни и (или) летальности (ИД₅₀ и ЛД₅₀);

- согласованность уровня антител и дозы возбудителя для конкретного вида птицы.

- оформление некоторых рекомендаций по контролю за болезнью.

Выявление субклинических болезней, определение эпизоотологических понятий (чувствительность и специфичность), а также перекрестной классификации птицы по состоянию здоровья (больных и здоровых) и результатам теста (положительным и ложноположительным) показаны в пункте 3.4. стр.162-200 в литературном источнике (4), где, используя матрицу формата 2х2 для диагностических исследований, можно провести расчеты и оценку параметров тестов: чувствительность, специфичность, истинную превалентность, мнимую превалентность, предсказательные значения отрицательного и положительного значений теста и отношения правдоподобия к ним, а также долю правильных прогнозов (абсолютную согласованность результатов). Данный раздел биометрических расчетов необходимо применять при использовании ЭМ, ПЦР, ИФА, РГА и других молекулярно-биологических тестов с высокой разрешающей способностью.

 

Метод матчинг (сравнения)

Предназначен для определения антигенного соответствия (показателя r₁) между производственными штаммами и эпизоотическими изолятами вируса (или, бактерий, грибов)  с целью определения наиболее родственного производственного штамма для борьбы с болезнью, вызванной конкретным эпизоотическим изолятом, выделенным по факту.

1 этап: на все участвующие в серологических реакциях агенты необходимо получить СС и рассчитать дозы изолятов и штаммов, например 100 ЭЛД₅₀/см² (ТЦД ЭЛД₅₀/см²).

В качестве референтных СС используются серии (пулы) сывороток крови от 5 особей, иммунизированных однократно моновалентными вакцинами.

 2 этап: в перекрёстной серологической реакции (РН, ИФА, РСК или др.) учитывают  титр референтной сыворотки крови против 100 ЭЛД производственного штамма (гомологичного вируса) и соответствующей дозы изучаемых полевых изолятов (гетерологичного вируса), т.е. титр каждой пробы сыворотки крови определяют в реакции с производственным гомологичным штаммом вируса. Титрование эпизоотического изолята проводят в диагностическом тесте с сывороткой, полученной на производственный штамм агента.

Определение активности сывороток крови

Условное обозначение положительных результатов, соответствующих разведениям сыворотки крови	Вируснейтрализующая, или, (например)  КС- активность сыворотки крови
	разведения	lg
1	1:16	1,204
2	1:22	1,342
3	1:32	1,505
4	1:45	1,653
5	1:64	1,806
6	1:90	1,954
7	1:128	2,107
8	1:180	2,255
9	1:256	2,408
10	1:360	2,556
11	1:512	2,709
12	1:720	2,857
13	1:1024	3,010
14	1:1440	3,158
15	1:2048	3,311
16	1:2880	3,459

 

Степень антигенного соответствия (r₁) полевого изолята вируса (бактерии) и производственного штамма (аналога) в РН расчитывают по формулам:

r₁ = титр^* референтной сыворотки крови с гетерологичным вирусом / титр^* референтной сыворотки крови с гомологичным вирусом

или  где титр^* – величина обратная разведению референтной сыворотки крови, в котором она активна с данным вирусом. lg ₁ -активность референтной сыворотки крови с гетерологичным вирусом выраженная в десятичных логарифмах. lg ₂  -активность референтной сыворотки крови с гомологичным вирусом выраженная в десятичных логарифмах. При r₁ > 0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса. При r₁ < 0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не способна защищать от эпизоотического вируса.

Интерпретация значений r₁в ИФА: r₁ – 0,4-1,0 – близкое антигенное родство между полевым изолятом и вакцинным штаммом; r₁ – 0,2-0,39 – полевой изолят антигенно родственен вакцинному штамму, вакцина из производственного штамма может быть использована, если не будет найдено более родственного штамма и при условии, что птица будет иммунизирована более 1 раза; r₁<0,2 – полевой изолят не родственен вакцинному штамму, который не приемлем для защиты от заражения полевым изолятом.

Учёт результатов основного опыта, например, РН.

Производственный штамм и эпизоотические изоляты вируса	Вируснейтрализующая или КС- активность референтной сыворотки		r1
	в разведениях	в lg
Производственный гомологичный штамм вируса	1:90	1,954	1,0
Эпизоотический изолят №1	1:45	1,653	0,5
Эпизоотический изолят №2	1:45	1,653	0,5
Эпизоотический изолят №3	1:22	1,324	0,35
Эпизоотический изолят №4	1:64	1,806	0,71

 

Разведение референтной сыворотки крови, в котором она активна с гомологичным вирусом (производственным штаммом) – 1:90, величина обратная разведению - 90, Разведение референтной сыворотки крови, в котором она активна с гетерологичным вирусом (эпизоотический изолят №1) – 1:45, величина обратная разведению – 45. Показатель антигенного соответствия (r₁):r₁ = 45/90 = 0,5 ≥ 0,3.

или r₁=10^{(1,653-1,954)}=10^-0,3=0,5. Разведение референтной сыворотки крови, в котором она активна с гетерологичным вирусом (эпизоотический изолят №2) – 1:45, величина обратная разведению – 45. Показатель антигенного соответствия (r₁): r₁ = 45/90 = 0,5. т.е. ≥ 0,3 или r₁=10^{(1,653-1,954)}=10^-0,3=0,5. Разведение референтной сыворотки крови, в котором она активна с гетерологичным вирусом (эпизоотический изолят №3) – 1:22, величина обратная разведению – 22. Показатель антигенного соответствия (r₁):

r₁ = 22/90 = 0,24. т.е. < 0,3 или r₁=10^{(1,345-1,954)}=10^-0,612=0,24.

Разведение референтной сыворотки крови, в котором она активна с гетерологичным вирусом (эпизоотический изолят №3) – 1:64, величина обратная разведению – 64. Показатель антигенного соответствия (r₁):r₁ = 64/90= 0,71. т.е. ≥ 0,3 или r₁=10^{(1,806-1,954)}=

10^-0,148=0,71.

Следовательно, полевые изоляты №1, №2, №4 и производственный штамм вируса являются близко родственными и вакцина из этого производственного штамма будет защищать от данных эпизоотических изолятов. Изолят №3 отличается от производственного штамма, следовательно, иммунизация птицы вакциной из производственного штамма может не оказаться эффективной против данного изолята, например, вируса и серовара бактерий.

Корректировку метода матчинг желательно подводить другими методами – контрольным заражением эпизоотическим агентом не менее трёх групп птиц – вакцинированной гомологичной (1) и гетерологичной вакциной (2) в присутствии «чистой» (3),например, при ВГУ или чуме, пастереллёзе и т.д., затем согласованности проводимых измерений и тестов, определения степени патогенности (при гриппе) и др.