Биометрические исследования при диагностике инфекционных болезней диких птиц

Цель биометрических тестов – с математической точки зрения показать степень воздействия опасности (патогенов) на ограниченную в пространстве популяцию диких птиц, биологически (в том числе инфекционно) связанных с жизнедеятельностью человека, объективно рассчитать и определить вероятность распространения зоонозов на обозначенной территории в реальном времени.

При математическом обследовании факторов риска распространения болезни необходимо учитывать сведения о резервуаре источника, переносчиках возбудителей, а также кофакторах, способствующих их передаче.

Известно, что для большинства возбудителей дикой птицы резервуар не ограничивается небольшим кругом диких и домашних птиц; часто к этому подключаются несколько десятков видов теплокровных, насекомых, земноводных, обитающих в воде, земле и воздушной среде. Например, в создании резервуара возбудителя чумы человека участвуют 372 различных вида, а в естественном заболевании туляремией 125 видов позвоночных, в том числе птиц, мфибий и рыб, а также 101 беспозвоночных (насекомых, клещей и т.д.). Псевдотуберкулёз уток, кур, индеек, фазанов, куропаток, канареек, серых крыс, обезьян и других видов, - одна из самых неизвестных инфекций, изучение которой проводят с применением математических расчетов.

В настоящее время благодаря ПЦР и нуклеотидному секвенированию фрагмента генома, кодирующего сайт резекции белка геммаглютинина, можно только предположить о степени патогенности изолята(штамма), например ортомиксовируса гриппа типа А подтипа H₅N₁. Для этого МЭБ рекомендует метод определения индекса патогенности (IVPI), где показатель 1,2 и более означает высокий, а менее 1,2 низкий уровень. Аналогичная ситуация складывается и при других болезнях птиц – вирусном гепатите утят (уток), чуме уток, адено - арбо - и парамиксовирусных инфекциях.

Предположим, что на основании предварительных данных 20% птиц инфицированы патогеном (превалентность,p=0,2) и при допустимой ошибке в 5% (L=0,05) необходимо отобрать пробы клинического материала. Следовательно, требуемый объем выборки (n) будет рассчитан:

 n=4*p*G/L², где G=1-p; коэффициент 4 – квадрат от 1,96, обеспечивающий 95% достоверность результата расчета.

n=4*0,2*0,8/0,05²=0,64/0,025=256 проб Обозначение: * - знак умножения.

При этом установлено, что число (N) птицы в популяции мало влияет на объем выборки, за исключением случаев, когда n > 0,1 N, т.е. более 10 %. Например, когда в популяции только 200 животных чувствительных к патогену, необходимо использовать метод Cannan, Рое (1982): n=1/n+1/N, где 1/256+1/200=0,0039+0,005=1/0,0089=112 проб (голов). Далее, если N=2000 голов, то 1/256+1/2000=1/0,0044=227 проб (голов). При N=4000 – 240 проб, а N=8000 – 250 проб и т.д., при p=0,2 (4).

Согласно модели нормального распределения Гаусса в массе отрицательно однородных единиц (наблюдений, измерений в популяции или во времени), составляющих совокупность, большинство членов оказываются среднего или близкого к нему размера, и чем дальше они стоят от среднего показателя, тем реже встречаются в изучаемой совокупности. Связь числового значения варьирующего признака (например, титра активности патогена или антител) и частотой (вероятностью) встречаемости в данной совокупности возможно отразить с помощью теоретического распределения вероятностей путем построения вариационного ряда по двум параметрам: среднего (M) и его ошибки (SE), а также доверительного интервала (SD). Предоставлены 2 примера при условной, 50%-ной превалентности (p=0,5).

 

Определение SE и SD при р=0,5.

Пример 1.

1.1. Определение ошибки среднего SE проводят по формуле:

SE=(1-p)*p/n, где p(количество заболевших или павших)= 3;а «n» – выборка проб патматериала в популяции животных (N=6).

1.1.1. p=3/6=0,5(*100)=50%, далее (1-0,5)*0,5/6=0,04;

√0,04=0,2(*100)=20%, таким образом, SE=50±20%.

Примечание: √ - корень квадратный. * - знак умножить.

1.1.2. Определение SE количества проб:

х=3*20/50=1,2, т.е. 3±1,2 пробы = 3+1,2=4,2 и 3-1,2=1,8. При 95% уровне доверительности интервал выборки проб возможен от 2,0 до 4,0 для получения убедительного (достоверного) диагноза.

Пример 2.

1.2. Определение доверительного интервала (SD) – промежутка в 4 стандартные ошибки (M±2m). В этом интервале может находиться неизвестная величина при заданной вероятности (95%) и нормальности распределения; часто применяется для выявления границ норм в клинических полевых условиях и диагностических тестах. Установлено, что чем меньше объем выборки проб патматериала, тем больше интервал SD.

1.2.1. p=х/n=3/6=50%;

1.2.2. n-х= разница (6-3=3).

1.2.3. Таблица 3.4. стр.152 в литературном источнике (8) определили 50(11-88)%.

1.2.4. х=3*11/50=0,66; х=3*88/50=5,3, т.е. интервал в количестве проб при M±2m округленно составит от 1,0 до 5,0 при 95% достоверности.

1. Определение стандартного отклонения (S) от среднего проводят после определения активности патогена в не менее трех опытах, используя метод Рида и Менча.

 

 

Для удобства расчета титра (50% эффективности, например, патогена) при десятикратных разведениях представляется модифицированная таблица 6. Представим, что в разведении 1:1млн (10^-6) произошла гибель 4 инфицированных утят (или лабораторных животных) из 4-х; для выражения реального титра к lg 6,0 необходимо добавить lg 0,50,что составит активность lg 6,5 ЛД_50..

Таблица 6

Расчет титра биологической активности патогена при десятикратных

разведениях.

х+хххх+0,50     оооо     оооо     оооо	х+хххх+0,66     хооо     оооо     оооо	х+хххх+0,83     хооо     хооо     оооо	хххх х+ххоо+0,0      оооо      оооо
хххх х+хххо+0,33     оооо     оооо	хххх х+ххоо+0,23      хооо      оооо	хххх х+хххо+0,50      хооо      оооо	хххх х+ххоо+0,48      ххоо       оооо
хххх х+хххо+0,76      ххоо      оооо	хххх х+хооо+0,0      ххоо       оооо	хххх х+хооо+0,50      хххо      оооо	хххх х+хххо+0,83      хооо      хооо
хххх х+ххоо+0,43     хооо     хооо	хххх хххо+0,50     хооо     оооо	хххх х+хооо+0,35     ххоо     хооо	хххх х+ххоо+0,75     ххоо     хооо
хххх     хххо х+хххо+0,17     оооо	Хххх     ххоо х+хххо+0,19     оооо	хххх     хооо х+хххо+0,19     хооо	хххх     ххоо х+хххо+0,16     хооо
хххх     ххоо х+ххоо+0,0     ххоо	хххх     ххоо х+хххо+0,35     ххоо	хххх     хххо х+ххоо+0,0     хооо	хххх     ххоо х+ххоо+0,28     хххо
хххх     хххо х+ххоо+0,24     ххоо	хххх     хххо х+хххо+0,32     хооо	хххх     хххо х+хххо+0,55     ххоо	хххх     хххо х+хххх+0,35     оооо
хххх     ххоо х+хххх+0,24     оооо	хххх     хооо х+хххх+0,12     оооо	хххх     хххо х+хххх+0,52     хооо	хххх     хххо х+хххх+0,76     ххоо

х – положительный результат (гибель одной особи);

о – отрицательный результат;

х+ – целое число логарифма плюс…

 

Определение стандартного отклонения (S) на примере получения трех показателей активности патогена – lg 6,0LD, lg 6,25LD и lg 7,0LD при eгo десятикратном разведении.

1.1. Перевод lg в антилогарифмы: 6,0=1 млн; 6,25=1778279; 7,0=10 млн.

1.2. Среднее (y) – меру центральной тенденции рассчитывали по формуле:

yi=∑yi/n, где ∑ - сумма антилогарифмов; n – количество yi. Таким образом,

y=12778279/3=4259426=lg 6,63.

Примечание: cyммa логарифмов (6,0+6,25+7,0) составит только 6,42.

1.3. Расчет S=√∑(yi-y)²/(n-1); 

S=√(6,0-6,63)²+(6,25-6,63)²+(7,0-6,63)²/(3-1)=

=√0,63²+0,38²+0,37²/2=√0,4+0,14+0,14/2=√0,68/2=0,55

В данном варианте S (lg 0,55) означает большую вариабельность индивидуального из трех значений относительно среднего значения (lg 6,33±0,55 ЛД₅₀/0,3 см³). В научных статьях часто ставят обозначения - M±m или S (две стандартные ошибки ±1m).

2. На примере получения шести показателей активности сывороток при двукратном разведении. Расчет S см. в п. 1.3.

2.1. Перевод предельных разведений в числовые выражения:

цельное =1; 1:2=2; 1:128=128 и т.д.

2.2. Среднее y=(условно)=370 (1/370 занимает среднее положение между 1:256 (log₂ 8,0) и 1:512 (log₂ 9,0); т.е. 1:370=log₂ 8,5.

2.3. Расчет S: S=36,6 (около 1:32=log₂ 5,0), т.е. S=1:370±1:32 (log₂ 8,5±5,0).

При 100% превалентности ошибка среднего (SE) и доверительный интервал (SD) не определяется.

Пример 3.

В субъекте страны популяция птицы (N) составляла 14000 голов, из них от болезни пало 300 в 4 районах (по 100, 50, 100 и 50). Из отобранных 40 проб патматериала положительными оказались 20 (10, 5, 2, и 3). Определить ошибку средней и доверительный интервал при 95% с условием, что выборка проб (n) по количеству более 10% общей популяции(n>0,1N).

Результаты: превалентность (р) павших особей = 0,2 (20%), p положительных проб = 0,5 (50%), ошибка средней (SE) = 50±8,0 (16,8 – 23,2 пробы), доверительный интервал (SD) = 50 (33,6 – 66,2), т.е. возможный интервал проб может составлять от 13 до 26 (13,5 – 26,5).

После установления диагноза (выявления возбудителя, его маркеров, наличие клинических признаков, патологоанатомических изменений и т.д.) проводят ретроспективные тесты – одно из них – выявление специфических антител в сыворотке крови птиц, например, при гриппе.

Пример. Выборка (n) проб сывороток крови – 20, из них положительные 5 в РЗГА с 8 ГАЕ и 4 в реакции нейтрализации (РН). Расчет S, SE и SD смотрите выше (титры условные).

Результаты для РЗГА:

А) y=88 (1:88 = log₂ 7,5), S=1:14= log₂ 3,5, т.е. log₂ 7,5±3,5.

Б) p=0,25 (25%).

В) SE=25±9,0%, SE проб = 5,0±1,8 (=3 – 7 проб).

Г) SD рассчитывают по данным таблицы 3.4. стр.152 в литературном источнике (2). Разность: 20-5=15 (n-х), p=25%, SD=25(49,1-8,7)%, количество проб от 2,0 до 10,0.

Результаты для РН:

y=1:14 (=log₂ 4,0), S=1:4,8 (=log₂ 3,0), 1:14±1:4,8= log₂ 4,0±3,0.

p=0,2 (20%), ошибка среднего 20±8%; SE=4,0±1,28, т.е. при 95% уровне достоверности интервал количества проб от 5,2 до 2,8 (от 3 до 5).

SD= при разности 16, p – 20% составляет 20 (43,7 – 5,7)%, а количество проб от 1,0 до 9,0.

Правильные отбор проб патматериалов и их сохранение позволят получить минимальные отклонения и ошибку от среднего показателя, а также сближение границ доверительного интервала. Для получения достоверных результатов диагностики по выделению патогeна необходимо, чтобы выборка составляла не менее 10% от количества исследуемых животных, а превалентность более 0,5 (50%). Установлено, что чем выше превалентность болезни, тем меньшее количество проб материалов требуется в выборке для того, чтобы выявить неблагополучие поголовья животных в прошлом или настоящем времени. Определение степени патогенности вируса гриппа типа А птиц. Метод заключается в следующем: десяти шести-недельным цыплятам кур вводят внутривенно по 0,1 см³ 10% раствора аллантоисной жидкости инфицированных исходным материалом КЭ. Наблюдение за птицей проводят в течение 10 суток. Расчет проводят по формуле: IVPI=(Б*1+ТБ*2+П*3)/10*N, где Б-число больных особей; ТБ- тяжело больных; П-павших и N – число особей птиц в опыте. Показатель 2,1 является пограничным между активностью высокопатогенного и низкопатогенного изолятами ортомиксовируса.

Ретроспективные тесты по исследованию сывороток крови желательно проводить в градиенте времени, минимум дважды. Исследования ведут с включением биоматематических расчетов; результаты которых достоверно показывают динамику концентрации специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови и возможность направления распространения агента болезни среди птиц одной или нескольких популяций (с учетом направления пути миграции, чувствительности, специфичности, патогенности и многих других факторов и кофакторов).

Нередко в лабораторной практике применяют компьтерные программы (подобные Bio Chec Uk Livitid) для расчета титра антител, анализа напряженности поствакцинального иммунитета и мониторинга эпизоотической ситуации при конкретной болезни. После оценки показателей оптической плотности (ОП) отрицательного, положительного контролей, а также разницы между ними, проводят тестирование исседуемых сывороток (ИС). Дифференциацию ИС проводят по величине S/P. S/P – отношение между разницей значения ОП ИС и значения ОП НС и разницей ОП СС и ОП НС.