Определение протеолитической активности молокосвертывающих препаратов

Молокосвертывающие препараты, помимо молокосвертывающей активности, обладают и протеолитической активностью, т.е. способностью расщеплять белки молока.

В связи с острым дефицитом в сыродельной промышленности натурального химозина (сычужный фермент) все большее применение находят его заменители микробного и животного происхождения. Однако не все препараты могут успешно заменять сычужный фермент. Препараты, имеющие высокую протеолитическую активность, вызывают глубокий гидролиз казеина, что приводит к резкому снижению качества сыра (появлению горечи). В связи с этим при определении пригодности какого–либо препарата в качестве заменителя сычужного фермента необходимо исследовать его протеолитическую активность.

Особенностью действия указанного препарата на казеиновую молекулу является избирательная атака им связи фенилаланил–метионин к –казеина, что в свою очередь приводит к открытию остатков фосфорной кислоты и объединению молекул параказеина в сгусток посредством образования Са-мостиков. Схематично это можно выразить следующим образом (рисунок 7):

Далее молекула казеина практически не гидролизуется, что обеспечивает стойкость сгустка и, далее, сырного зерна. Графически это изображено на рисунке 8.

В данном случае подъем кривой в течении 15 минут (кривая 1) отражает образование ГМП. В дальнейшем гидролиз практически отсутствует. Отклонение от этого (кривая 2) как правило приводит к нарушениям в образовании сгустка и созревания сыров. Расстояние между кривыми 1 и 2 называется мерой неспецифичного протеолиза (МНП). Чем больше эта величина, тем выше опасность появления горького, нечистого и других привкусов в готовом продукте.

 

Рисунок 7 – Схема действия сычужного фермента на молекулу казеина

 

Рисунок 8 – График зависимости образования продуктов гидролиза казеина от времени реакции

 

В данной работе ставится задача определить пригодность испытуемого препарата в качестве заменителя сычужного фермента исходя из интенсивности гидролиза казеина во времени.

Принцип метода. Определение активности сычужного фермента и его заменителей микробного и животного происхождения основано на учете накопления продуктов гидролиза казеина, растворимых в 1,125 М трихлоруксусной кислоте через определенный промежуток времени от начала реакции.

Ход работы. В пробирки отбирают по 2 мл приготовленного казеинового субстрата и термостатируют 5 мин. при температуре 35 °С. Затем вносят по 0,5 мл раствора ферментного препарата с одновременной фиксацией времени. Реакцию прекращают через 5, 10, 15, 20, 30, 40, 90 минут путем добавления 5 мл 1,125 М раствора ТХУ. Полученную смесь перемешивают и оставляют на 30минут, после чего ее фильтруют через двойной складчатый фильтр. Параллельно с указанным определением ставятся нулевая и холостая пробы.

Для нулевого значения в пробирку отбирают 2 мл раствора субстрата, 5 мл 1,125 М раствора ТХУ и 0,5 мл раствора ферментного препарата.

Результат холостого опыта исключает экстинцию реактивов. Для этого к 5 мл 1.125 М раствора ТХУ добавляют 2,5 мл дистиллированной воды и фильтруют так же, как и в случае нулевого опыта через 30 минут. В фильтрате определяют продукты гидролиза казеина, растворимые в 0,75 М растворе ТХУ. Определенное количество фильтрата (не более 1 мл) отбирают в пробирки с таким расчетом, чтобы концентрация полученных продуктов распада казеина во время колориметрирования находилась в пределах от 20 до 150, нейтрализуют равным количеством 0,75 М раствора NaOH (с целью обеспечения необходимого значения рН для реакции с медным и фенольным реагентами), добавляют дистиллированную воду до объема 2 мл, а затем все необходимые реактивы, предусмотренные методом Лоури. После 45–минутной экспозиции замеряют экстинцию при 750 нм по отношению к значению холостого опыта.

Для построения калибровочной кривой (20 – 200) служит казеин по Гамммарстену (см. Методические указания к выполнению УИРС по биохимии для студентов спец. 1017, работу № 5 "Определение белка в молоке по методу Лоури"). Предполагается, что продукты распада казеина дают те же экстинции, что и неизменный казеин.

Опыт проделывают трижды.

Расчет полученных данных

Протеолитическая активность показыват, какое количество мг белка казеина переводится в растворимую форму одним миллиграммом ферментного препарата при 35 °С, рН 6,6, за определенный промежуток времени. Расчет протеолитической активности (Е_р) производится по следующей формуле:

                    (16)

где: Е_р – протеолитическая активность ферментного препарата;

С – концентрация ферментного препарата, мг;

А – количество растворимых продуктов гидролиза казеина за определенный промежуток времени, мг

,                      (17)????

где: В – количество продуктов гидролиза казеина в соответствующе измеренной экстинкции;

7,5 – объем пробы (2 мл субстрата, 0,5 мл ферментного препарата, 5 мл раствора ТХУ);

V – количество раствора, взятого для колориметрирования, мл.

Материалы и реактивы. Казеин (см. Приложение 1, п.7); реактив А, В, С (см. Приложение 1, п.17); реактив Фолина (см. Приложение 1, п. 8); ферментные препараты; 1,125 М раствор ТХУ; 0,75 М раствор едкого натра.

Оборудование. Складчатый фильтр; пробирки; пипетки на 1 и 2 мл с ценой деления 0,05 мл; ФЭК–60 или ФЭК–56М.

Эстеразы

Липаза или триацилглицероллипаза катализирует расщепление жиров (три-
ацилглицеринов) на глицерин и жирные кислоты. Реакция идет по схеме:

 

По существующей классификации ферментов липаза принадлежит к классу гидролаз и подклассу эстераз, действующих на сложноэфирные связи.

Как и в случае других гидролаз, радикал гис активного центра фермента служит для переноса протонов, радикал сер – для акцептирования ацильной группы, высвобождающейся в момент распада сложноэфирной связи в молекуле триглицерида. Радикал изолейцина взаимодействуют с углеводородным радикалом остатка высшей жирной кислоты и способствует закреплению молекулы триглицерида в активном центре фермента (см. рисунок 7).

 

Рисунок 9 – Механизм действия триацилглицероллипазы

Скорость расщепления зависит от длины цепи жирных кислот. Скорость реакции уменьшается в ряду: три–, ди–, и моноглицериды.

Источником для получения промышленных препаратов липазы являются поджелудочная железа, семена клещевины.

Активаторами липазы служат соли желчных кислот. Активирующий эффект основан на эмульгирующем действии.

рН–оптимум активности (и стабильности) у разных ферментных препаратов различен и зависит от источника фермента. Так, панкреатическая липаза имеет оптимум активности при рН = 8, липаза молока – при рН = 9, липаза из клещевины – при рН = 4,3, микробные липазы – при рН = 5–6. Из перечисленных липаз наиболее термостабильной является липаза молока.

Липазам принадлежит важная роль в технологии продуктов питания. В молоке слабая липазная активность способствует образованию аромати-зирующих веществ; липаза пшеницы и других злаковых культур способствуют порче муки. Наконец, микробные препараты липазы используются для гидролиза жира в тех случаях, когда необходимо омыление при сохранении биологически активных жирорастворимых веществ (например, токоферола).