Общий объем реакционной смеси – 50 мкл, включая объем пробы РНК – 25 мкл.

ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед проведением анализа. Смешивать реагенты из расчета на необходимое число реакций, включающее тестирование исследуемых и контрольных образцов.

1. До начала работы разморозить, тщательно перемешать на вортексе все реагенты набора и осадить капли с крышек пробирок.

2. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации с учетом количества исследуемых, контрольных образцов и калибраторов.

3. Для приготовления реакционной смеси необходимо в пробирку с DTT лиофилизированным добавить все содержимое пробирки с ОТ-ПЦР-смесью-2- FEP / FRT. Тщательно перемешать смесь на вортексе и осадить капли с крышки пробирки кратковременным центрифугированием. Приготовленная смесь может храниться при температуре от 2 до 8 °С в течение 1 недели. Для приготовления реакционной смеси необходимо в отдельной одноразовой пробирке смешать реагенты из расчета на 1 реакцию: 15 мкл ОТ-ПЦР-смеси-1- FRT ВИЧ, 10 мкл смеси ОТ-ПЦР-смеси-2- FEP / FRT и DTT лиофилизированного, 1,0 мкл полимеразы (Ta q F) и 0,5 мкл TM-Ревертазы (M M lv). Тщательно перемешать смесь на вортексе и осадить капли с крышки пробирки кратковременным центрифугированием. Для 12 (стандартная панель экстракции комплектом реагентов «РИБО-сорб-12») – 16 (экстракция с использованием двух картриджей easyMAG) образцов после экстракции рекомендуется готовить реакционную смесь на 20 реакций, для этого в пробирку с DTT лиофилизированным добавить все содержимое пробирки с ОТ-ПЦР-смесью-2- FEP / FRT, все содержимое пробирки с ОТ-ПЦР-смесью-1- FRT ВИЧ, все содержимое пробирки с полимеразой (TaqF) и все содержимое пробирки с ТМ-Ревертазой (M M lv). Приготовленная смесь не хранится.

4. Внести в пробирки по 25 мкл готовой реакционной смеси. Неиспользованные остатки реакционной смеси выбросить.

5. Используя наконечник с фильтром, в пробирки с реакционной смесью внести по 25 мкл проб РНК, полученных в результате экстракции из исследуемых или контрольных образцов. Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха.

ВНИМАНИЕ! При добавлении проб РНК, выделенных с помощью комплекта реагентов «РИБО-сорб», «МАГНО-сорб» и «NucliSENS easyMAG», необходимо избегать попадания сорбента в реакционную смесь.

6. Поставить контрольные реакции:

а) положительный контроль экстракции (ПК-1) – внести в пробирку 25 мкл пробы РНК, выделенной из образца ПКО-1-ВИЧ.

б) положительный контроль экстракции (ПК-2) – внести в пробирку 25 мкл пробы РНК, выделенной из образца ПКО-2-ВИЧ.

в) отрицательный контроль экстракции (ОК) – внести в пробирку 25 мкл пробы РНК, выделенной из образца ОКО.

г) положительный контроль ПЦР (К+₁) – внести в две пробирки по 25 мкл ДНК-калибратора КВ1 ВИЧ,

д) положительный контроль ПЦР (К+₂) – внести в две пробирки по 25 мкл ДНК-калибратора КВ2 ВИЧ.

Содержимое пробирок с добавленными контрольными образцами необходимо тщательно перемешать пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха.

При подозрении на возможную контаминацию также необходима постановка отрицательного контроля ПЦР (К–). Для этого в пробирку с готовой реакционной смесью внести 25 мкл буфера для элюции.

Рекомендуется перед постановкой в амплификатор планшетного типа осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).

Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени»

1. Запрограммировать прибор (амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени») для выполнения соответствующей программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала «ВИЧ-Монитор-FRT» (см. табл. 1, 2, 3).

Таблица 1

Программа «ВИЧ-Монитор- FRT» для приборов роторного типа

Таблица 2

Программа «ВИЧ-Монитор- FRT» для приборов планшетного типа (за исключением приборов фирмы «ДНК-Технология»)

Таблица 3