Форматы и формы выпуска набора реагентов

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов

для количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

«АмплиСенс ^Ò ВИЧ-Монитор-FRT»

АмплиСенс ^Ò

Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Российская Федерация, 111123, город Москва, улица Новогиреевская, дом 3А

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.. 3

НАЗНАЧЕНИЕ.. 3

ПРИНЦИП МЕТОДА.. 3

ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ.. 4

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ.. 5

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ.. 6

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.. 9

ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.. 11

ФОРМАТ FRT. 13

СОСТАВ.. 13

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ.. 15

ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ.. 16

ПРОВЕДЕНИЕ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ РНК И АМПЛИФИКАЦИИ кДНК С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ». 17

А. Подготовка пробирок для амплификации.. 17

Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени». 19

АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.. 20

СРОК ГОДНОСТИ, УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ.. 24

ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ИЗГОТОВИТЕЛЯ.. 25

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «РИБО-сорб-12» 26

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «РИБО-преп» 29

ПРИЛОЖЕНИЕ В. Экстракция РНК с использованием автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот NucliSENS easyMAG (bioMerieux, Франция) 32

В1. Экстракция РНК из 100 мкл образца, лизис вне прибора. 32

В2. Экстракция РНК из 100 мкл или 1000 мкл образца с автоматическим лизисом в приборе. 33

ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб» 36

Г1. Экстракция из 1000 мкл образца плазмы.. 36

Г2. Экстракция из 200 мкл образца плазмы.. 38

Г3. Экстракция нуклеиновых кислот с помощью автоматической станции (например, с помощью роботизированной станции для дозирования жидкостей Xiril (Xiril AG, Швейцария) 40

ПРИЛОЖЕНИЕ Д. Порядок работы при использовании комплектов для экстракции РНК, не входящих в состав данного набора реагентов (при работе с формой 5) 42

СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ.. 45

 

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:

ВИЧ-1	- вирус иммунодефицита человека типа 1
ВКО	- внутренний контрольный образец
К–	- отрицательный контроль ПЦР
К+	- положительный контроль ПЦР
ОК	- отрицательный контроль экстракции
ОКО	- отрицательный контрольный образец
ОТ	- обратная транскрипция
ПК	- положительный контроль экстракции
ПКО	- положительный контрольный образец
ПЦР	- полимеразная цепная реакция
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора	-федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
FRT	- флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»

НАЗНАЧЕНИЕ

Набор реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT» предназначен для количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Материалом для проведения ПЦР служат пробы РНК, выделенные из плазмы крови.

ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике заболевания[1].

ПРИНЦИП МЕТОДА

Принцип тестирования основывается на экстракции РНК из плазмы крови совместно с внутренним контрольным образцом (ВКО), проведении реакции обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (формат FRT). По каналу, соответствующему флуорофору FAM, детектируется продукт амплификации ВКО, который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. По каналу, соответствующему флуорофору JOE, детектируется продукт амплификации кДНК ВИЧ-1. Положительные контрольные образцы этапа экстракции ПКО-1-ВИЧ и ПКО-2-ВИЧ детектируются по каналам, соответствующим флуорофорам FAM (ВКО) и JOE (ВИЧ-1). Контрольные образцы амплификации (ДНК-калибраторы) – КВ1 ВИЧ и КВ2 ВИЧ, а также калибратор HIV -Q (при работе с формой 5), аналогично детектируются по каналам, соответствующим флуорофорам FAM (ВКО) и JOE (ВИЧ-1).

Аналитическая специфичность

Оценка аналитической специфичности набора реагентов проведена посредством добавления в реакцию геномной ДНК/РНК следующих организмов и вирусов: вирус гепатита А, вирус гепатита B, вирус гепатита C, вирус гепатита D, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус простого герпеса типы 1, 2, вирус ветряной оспы, вирус герпеса человека типы 6, 8, парвовирус В19, вирус клещевого энцефалита, вирус лихорадки западного Нила, аденовирус типы 2, 3, 7, E scherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Homo sapiens.

Перекрестные реакции для указанных организмов и вирусов зарегистрированы не были.

ФОРМАТ FRT

СОСТАВ

Комплект реагентов «РИБО-сорб-12» –комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала– включает:

Реактив	Описание	Объем, мл	Кол-во
Лизирующий раствор	Прозрачная бесцветная жидкость[4]	5,8	4 флакона
Раствор для отмывки ВИЧ	Прозрачная бесцветная жидкость4	8,0	4 флакона
Раствор для отмывки 3	Прозрачная бесцветная жидкость	15,0	4 флакона
Раствор для отмывки 7	Прозрачная бесцветная жидкость	6,0	4 флакона
Сорбент	Суспензия белого цвета	0,4	4 пробирки
Буфер для элюции	Прозрачная бесцветная жидкость	1,2	4 пробирки

Комплект реагентов рассчитан на выделение РНК/ДНК из 48 проб, включая контроли. Входит в состав формы комплектации 1.

Комплект реагентов «РИБО-преп» вариант 50 – комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала – включает:

Реактив	Описание	Объем, мл	Кол-во
Раствор для лизиса	Прозрачная жидкость голубого цвета4	15	1 флакон
Раствор для преципитации	Прозрачная бесцветная жидкость	20	1 флакон
Раствор для отмывки 3	Прозрачная бесцветная жидкость	25	1 флакон
Раствор для отмывки 4	Прозрачная бесцветная жидкость	10	1 флакон
РНК-буфер	Прозрачная бесцветная жидкость	1,2	4 пробирки

Комплект реагентов рассчитан на выделение РНК/ДНК из 50 проб, включая контроли. Входит в состав формы комплектации 2.

Комплект реагентов «МАГНО-сорб» вариант 100-1000 –комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала – включает:

Реактив	Описание	Объем, мл	Кол - во
Лизирующий раствор МАГНО-сорб	Прозрачная бесцветная жидкость[5]	70	4 флакона
Компонент А	Прозрачная бесцветная жидкость	0,6	4 пробирки
Раствор для отмывки 5	Прозрачная бесцветная жидкость5	60	4 флакона
Раствор для отмывки 6	Прозрачная бесцветная жидкость	20	4 флакона
Раствор для отмывки 7	Прозрачная бесцветная жидкость	6,0	4 флакона
Магнетизированная силика	Суспензия черного цвета	0,9	4 пробирки
Буфер для элюции	Прозрачная бесцветная жидкость	1,2	12 пробирок

Комплект реагентов рассчитан на выделение РНК/ДНК из 100 проб объемом 1000 мкл, включая контроли. Входит в состав формы комплектации 4.

Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT –комплект реагентов для проведения реакции обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» – включает:

Реактив		Описание	Объем, мл	Кол-во

DTT лиофилизированный

Порошок белого цвета --- 4 пробирки

ОТ-ПЦР-смесь-1-FRT ВИЧ

Прозрачная бесцветная жидкость 0,3 4 пробирки

ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT

Прозрачная бесцветная жидкость 0,2 4 пробирки

Полимераза (TaqF)

Прозрачная бесцветная жидкость 0,02 4 пробирки

ТМ-Ревертаза (MMlv)

Прозрачная бесцветная жидкость 0,01 4 пробирки

ДНК-калибраторы

КВ1 ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость 0,1 4 пробирки КВ2 ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость 0,1 4 пробирки

Буфер для элюции

Прозрачная бесцветная жидкость 1,2 2 пробирки

Комплект реагентов рассчитан на проведение 80 реакций амплификации, включая контроли и калибраторы. Входит в состав форм комплектации 1, 2, 5 и 6 (в количестве 1 шт.) и формы 4 (в количестве 2 шт.).

К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:

Реактив	Описание	Объем, мл	Кол-во
ОКО	Прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета	1,2	4 пробирки
ПК O -1-ВИЧ	Прозрачная бесцветная жидкость	0,06	4 пробирки
ПК O -2- ВИЧ	Прозрачная бесцветная жидкость	0,06	4 пробирки
BKO ВИЧ- M - FRT	Прозрачная бесцветная жидкость	0,28	4 пробирки

Комплект реагентов «Комплект для калибровки HIV - Q» включает:

Реактив	Описание	Объем, мл	Кол-во
Калибратор HIV - Q	Порошок желтого цвета	---	1 пробирка
Растворитель Q	Прозрачная бесцветная жидкость	1,2	3 пробирки

Комплект реагентов рассчитан на проведение 1 калибровки. Входит в состав формы комплектации 5.

К набору реагентов прилагается на цифровом носителе или находится на официальном сайте Изготовителя программное обеспечение AmpliSens Soft Monitor FRT (в формате Microsoft^® Excel) для автоматической обработки результатов.

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ

ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:

- Экстракция РНК из исследуемых образцов.

- Проведение реакции обратной транскрипции и амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

- Анализ и интерпретация результатов.

А. Подготовка пробирок для амплификации

Контроль

Порядок работы

1. Лизирующий раствор и раствор для отмывки ВИЧ (если они хранились при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 60 °С до полного растворения кристаллов.

2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл (включая отрицательный и положительный контроли экстракции). Промаркировать пробирки.

3. На дно каждой пробирки внести по 10 мкл ВКО ВИЧ-М- FRT.

4. В пробирки внести по 450 мкл лизирующего раствора.

При большом объеме образцов для облегчения процедуры экстракции допускается смешивание в отдельном одноразовом флаконе лизирующего раствора и ВКО (из расчета на один образец 450 мкл лизирующего раствора и 10 мкл ВКО)с последующим внесением по 450 мкл смеси в заранее приготовленные пробирки на 1,5 мл.

При экстракции РНК из 12 проб, включая контроли, допускается добавление во флакон с лизирующим раствором 130 мкл ВКО ВИЧ-М- FRT. После тщательного перемешивания внести по 450 мкл смеси в заранее приготовленные пробирки на 1,5 мл. Смесь лизирующего раствора с ВКО ВИЧ-М- FRT хранить не более 2 ч.

5. В пробирки внести по 100 мкл исследуемых образцов, используя наконечники с фильтром. Закрыть крышки и перемешать на вортексе. Осадить на центрифуге для сброса капель жидкости с крышки.

6. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1, ПК-2). Для этого в приготовленную пробирку ПКО-1 с лизирующим раствором добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-1-ВИЧ, а в приготовленную пробирку ПКО-2 с лизирующим раствором добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-2-ВИЧ, перемешать содержимое пробирок на вортексе и осадить капли жидкости с крышки.

7. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для этого в пробирку с лизирующим раствором добавить 100 мкл ОКО, перемешать на вортексе и осадить капли жидкости с крышки.

8. Ресуспендировать сорбент, интенсивно перемешивая на вортексе. Добавить в каждую пробирку отдельным наконечником по 25 мкл ресуспендированного сорбента.

9. Перемешать содержимое пробирок на вортексе и оставить на 10 мин при комнатной температуре, тщательно перемешивая каждые 2 мин.

10.Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 7 тыс g (например, 10 тыс об/мин для центрифуги MiniSpin, Eppendorf) в течение 1 мин.

11.Отобрать надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсасыватель.

12.Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки ВИЧ. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 7 тыс g в течение 1 мин. Отобрать надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсасыватель.

13.Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 7 тыс g в течение 1 мин. Отобрать раствор для отмывки 3 из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсасыватель.

14.Повторить отмывку раствором для отмывки 3.

15.Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 7. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 7 тыс g в течение 1 мин. Полностью отобрать раствор для отмывки 7 из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсасыватель.

16.Высушить сорбент, поместив пробирки с открытыми крышками в термостат при температуре 60 °С на 10 мин.

17.Добавить в каждую пробирку по 50 мкл буфера для элюции и ресуспендировать сорбент. Прогреть в термостате при температуре 60 °С 5 мин, перемешать на вортексе и осадить сорбент на центрифуге при 12 тыс g (например, 13 400 об/мин для центрифуги MiniSpin, Eppendorf) в течение 1 мин.

РНК-пробы готовы к постановке реакции ОТ-ПЦР, которую рекомендуется проводить сразу же после получения очищенной РНК.

Примечание – При появлении признаков взмучивания сорбента необходимо вновь осадить сорбент на центрифуге при 12 тыс g в течение 1 мин.

РНК-пробы не рекомендуется хранить дольше 30 мин при температуре от 2 до 8 °С. Для длительного хранения препарата необходимо, не захватывая сорбент, перенести надосадочную жидкость в стерильную пробирку и хранить при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 мес или не выше минус 68 °С в течение года.

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «РИБО-преп»

Для повышения чувствительности рекомендуется провести предварительное ультрацентрифугирование 1 мл плазмы в течение 1 ч при скорости центрифуги не менее 24000 g при температуре от 2 до 8 °С. Затем отобрать 900 мкл надосадочной жидкости и работать с осадком (100 мкл) как описано ниже. Ультрацентрифугирование проводится в пробирках с завинчивающимися крышками на 1,5 мл.

Порядок работы

1. Раствор для лизиса (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре до 65 °С до полного растворения кристаллов.

2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл (включая отрицательный и положительный контроли экстракции). Промаркировать пробирки.

3. На дно каждой пробирки внести по 10 мкл ВКО ВИЧ-М- FRT.

4. В пробирки внести по 300 мкл раствора для лизиса.

При большом объеме образцов для облегчения процедуры экстракции допускается смешивание в отдельном одноразовом флаконе раствора для лизиса и ВКО (из расчета на один образец 300 мкл раствора для лизиса и 10 мкл ВКО)с последующим внесением по 300 мкл смеси в заранее приготовленные пробирки на 1,5 мл.

5. В пробирки внести по 100 мкл исследуемых образцов, используя наконечники с фильтром. Закрыть крышки и перемешать на вортексе. Осадить на центрифуге для сброса капель жидкости с крышки.

6. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1, ПК-2). Для этого в приготовленную пробирку ПКО-1 с раствором для лизиса добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-1-ВИЧ, а в приготовленную пробирку ПКО-2 с раствором для лизиса добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-2-ВИЧ, перемешать содержимое пробирок на вортексе.

7. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для этого в пробирку с раствором для лизиса добавить 100 мкл ОКО, перемешать на вортексе и осадить капли жидкости с крышки.

8. Содержимое пробирок прогреть 5 мин при 65 °С в термостате, перемешать на вортексе и осадить капли жидкости с крышки.

9. Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешать на вортексе.

10.Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при 12 тыс g (например, 13 400 об/мин для центрифуги MiniSpin, Eppendorf).

11.Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

12.Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.

13.Центрифугировать при 12 тыс g в течение 1-2 мин на микроцентрифуге.

14.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

15.Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.

16.Центрифугировать при 12 тыс g в течение 2 мин на микроцентрифуге.

17.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

18.Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты).

19.Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

20.Центрифугировать пробирки при 12 тыс g в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенные РНК.

РНК-пробы готовы к постановке реакции ОТ-ПЦР, которую рекомендуется проводить сразу же после получения очищенной РНК.

РНК-пробы не рекомендуется хранить дольше 30 мин при температуре от 2 до 8 °С. Для длительного хранения препарат необходимо хранить при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 мес или не выше минус 68 °С в течение года.

ПРИЛОЖЕНИЕ В. Экстракция РНК с использованием автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот NucliSENS easyMAG (bioMerieux, Франция)

Порядок работы

1. Включить прибор NucliSENS easyMAG и подготовить его к экстракции РНК, следуя инструкции к прибору.

2. В окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца следующие параметры: название образца, материал (Matrix) для экстракции РНК –плазма (Plasma), объем образца (Volume) – 0,1 ml, объем элюции (Eluate) – 55 mkl, тип образца (Type) – Lysed, очередность экстракции РНК в образцах (Priority) – normal.

3. Создать новый протокол экстракции РНК и сохранить его. В протоколе указать, что лизис и инкубация образцов происходит вне прибора: On - board Lysis Buffer Dispensing - No, On - board Lysis Incubation - No.

4. Перенести запрограммированные образцы в созданный протокол.

5. В ячейки картриджа easyMAG, предназначенные для экстракции РНК в приборе NucliSENS easyMAG, внести по 450 мкл буфера для лизиса NucliSens.

6. В каждую ячейку добавить 100 мкл исследуемой плазмы отдельным наконечником с фильтром, тщательно перемешать пипетированием.

7. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1, ПК-2). Для этого в приготовленную ячейку картриджа ПКО-1 с буфером для лизиса NucliSens добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-1-ВИЧ, а в приготовленную ячейку картриджа ПКО-2 с буфером для лизиса NucliSens добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-2-ВИЧ, тщательно перемешать пипетированием.

8. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для этого в ячейку картриджа с буфером для лизиса NucliSens добавить 100 мкл ОКО, тщательно перемешать пипетированием.

9. Оставить картриджи с образцами на 10 мин при комнатной температуре для прохождения лизиса.

10.В отдельной стерильной пробирке на 1,5 мл смешать магнитную силику NucliSens и ВКО стерильными наконечниками c фильтром (см. табл. 5).

Таблица 5

Порядок работы

1. Лизис образца происходит в автоматическом режиме в приборе NucliSENS easyMAG. В каждую ячейку картриджа easyMAG, предназначенную для экстракции РНК в приборе NucliSENS easyMAG, необходимо добавить 100 мкл или 1 мл исследуемой плазмы отдельным наконечником с фильтром.

2. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1, ПК-2). Для этого в ячейку картриджа, предназначенную для ПК-1 добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-1-ВИЧ, а в ячейку картриджа, предназначенную для ПК-2 добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-2-ВИЧ.

3. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для этого в ячейку картриджа, предназначенную для ОК, добавить 100 мкл ОКО.

4. Включить прибор NucliSENS easyMAG и подготовить его к экстракции РНК, следуя инструкции к прибору.

5. В окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца следующие параметры: название образца, материал (Matrix) для экстракции РНК –плазма (Plasma), объем образца (V olume) – 100 mkl или 1 ml, в зависимости от объема используемого клинического материала, объем элюции (Eluate) – 55 mkl, тип образца (T y pe) – Primary, очередность экстракции РНК в образцах (P riority) – normal.

6. Создать новый протокол экстракции РНК и сохранить его. В протоколе указать, что лизис и инкубация образцов происходит в приборе: On-board Lysis Buffer Dispensing –Yes, On-board Lysis Incubation – Yes.

7. Перенести запрограммированные образцы в созданный протокол.

8. Загрузить картриджи с образцами в прибор, установить наконечники, запустить программу экстракции РНК с лизисом образцов в приборе (O n board).

9. Дождаться, пока автоматическая станция NucliSENS easyMAG не остановит работу в положении Instrument State-Idle (приблизительно 15 мин).

10.В отдельной стерильной пробирке на 1,5 мл смешать магнитную силику NucliSens и ВКО стерильными наконечниками с аэрозольным барьером (см. табл. 5).

11.Открыть крышку прибора и добавить в каждую ячейку отдельным наконечником по 20 мкл подготовленной смеси магнитной силики NucliSens и ВКО. Жидкость в каждой ячейке тщательно перемешать пипетированием с помощью дозатора отдельными наконечниками с фильтром на 1000 мкл.

12.Запустить на приборе программу продолжения экстракции РНК.

13.После окончания экстракции РНК, извлечь картриджи из прибора и не позднее 30 мин после окончания процедуры экстракции РНК провести реакцию ОТ-ПЦР.

Для длительного хранения препарат необходимо перенести в одноразовую пробирку и хранить при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 мес или не выше минус 68 °С в течение года.

ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб»

Порядок работы

1. Лизирующий раствор МАГНО-сорб и раствор для отмывки 5 прогреть при температуре 60 °С до полного растворения кристаллов.

2. Подготовить необходимое количество одноразовых пробирок на 5 мл и одноразовых крышек (включая отрицательный и положительный контроли экстракции) и промаркировать их.

3. При экстракции РНК из 24 образцов:

- во флакон с лизирующим раствором МАГНО-сорб (70 мл) внести 280 мкл ВКО ВИЧ-М- FRT, все содержимое пробирки с компонентом А (0,6 мл) и все содержимое пробирки с магнетизированной силикой (0,9 мл);

- закрыть крышку флакона и аккуратно перемешать переворачиванием 5-7 раз, избегая образования пены;

- внести в пробирки на 5 мл по 2,6 мл подготовленной смеси лизирующего раствора МАГНО-сорб, ВКО, компонента А и магнетизированной силики.

4. При экстракции РНК менее чем из 24 образцов:

- смешать в отдельной стерильной пробирке на 1,5 мл ВКО ВИЧ-М-FRT, компонент А и магнетизированную силику из расчета на одну точку: 10 мкл ВКО ВИЧ-М- FRT, 20 мкл компонента А и 30 мкл магнетизированной силики. При расчете необходимо учитывать запас – рассчитывать на одну точку больше, например:

Количество образцов для экстракции РНК	ВКО ВИЧ-М- FRT (мкл)	Компонент А (мкл)	Магнетизированная силика (мкл)
6	70	140	210
12	130	260	390
18	190	380	570

- внести в пробирки на 5 мл по 60 мкл подготовленной смеси ВКО ВИЧ-М- FRT, компонента А и магнетизированной силики;

- внести в пробирки на 5 мл по 2,6 мл лизирующего раствора МАГНО-сорб.

5. Добавить в каждую пробирку с лизирующим раствором 1 мл исследуемого образца плазмы, перемешать пипетированием и закрыть крышкой.

6. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1, ПК-2). Для этого в приготовленную пробирку ПКО-1 с лизирующим раствором добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-1-ВИЧ, а в приготовленную пробирку ПКО-2 с лизирующим раствором добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-2-ВИЧ, перемешать пипетированием и закрыть крышкой.

7. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для этого в пробирку с лизирующим раствором добавить 100 мкл ОКО, перемешать пипетированием, закрыть крышкой.

8. Поместить пробирки в термостат с температурой 60 °С на 10 мин.

9. Перенести пробирки в магнитный штатив на 6 мин.

10.Используя наконечники без фильтра на 1000 мкл, осторожно, по стенке пробирки отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. Перенести пробирки в обычный штатив.

11.Добавить в пробирки по 700 мкл раствора для отмывки 5, пробирки закрыть крышкой.

12.Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл (включая отрицательный и положительные контроли экстракции) и промаркировать их.

13.Ресуспендировать магнитный носитель со стенок осторожным вортексированием, а затем пипетированием, и перенести всю жидкость в приготовленные пробирки на 1,5 мл. На вортексе осадить капли жидкости с крышок и стенок пробирок.

14.Переставить пробирки в магнитный штатив и инкубировать 2 мин.

15.Отобрать надосадочную жидкость и перенести пробирки в обычный штатив.

16.Добавить 700 мкл раствора для отмывки 5, ресуспендировать магнитный носитель, и повторить пп. 14-15.

17.Аналогично провести одну отмывку 700 мкл раствора для отмывки 6.

18.Добавить 200 мкл раствора для отмывки 7, перемешать, а затем коротко осадить капли на вортексе.

19.Переставить пробирки в магнитный штатив на 1 мин, затем отобрать надосадочную жидкость.

20.Высушить сорбент, оставив пробирки с открытыми крышками на магнитном штативе в течение 10 мин.

21.Добавить 50 мкл буфера для элюции и перемешать на вортексе.

22.Поместить пробирки в термостат при температуре 60 °С на 5 мин, через 2 мин перемешать на вортексе.

23.Коротко осадить капли на вортексе и переставить пробирки в магнитный штатив. Инкубировать 2 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенные РНК.

ВНИМАНИЕ! Отбор очищенных РНК для проведения реакции ОТ-ПЦР осуществляется не снимая пробирок с магнитного штатива.

РНК-пробы не рекомендуется хранить дольше 30 мин при температуре от 2 до 8 °С. Для длительного хранения препарата необходимо, не захватывая сорбент, перенести надосадочную жидкость в стерильную пробирку и хранить при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 мес, или не выше минус 68 °С в течение года.

Порядок работы

1. Лизирующий раствор МАГНО-сорб и раствор для отмывки 5 прогреть при температуре 60 °С до полного растворения кристаллов.

2. Подготовить необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл (включая отрицательный и положительные контроли экстракции) и промаркировать их.

3. Смешать в отдельной стерильной пробирке на 1,5 мл ВКО ВИЧ-М-FRT, компонент А и магнетизированную силику из расчета на одну точку: 10 мкл ВКО ВИЧ-М- FRT, 10 мкл компонента А и 20 мкл магнетизированной силики. При расчете необходимо учитывать запас – рассчитывать на одну точку больше, например:

Количество образцов для экстракции РНК	ВКО ВИЧ-М- FRT (мкл)	Компонент А (мкл)	Магнетизированная силика (мкл)
6	70	70	140
12	130	130	260
18	190	190	380
24	250	250	500

4. Внести в пробирки по 40 мкл подготовленной смеси ВКО ВИЧ-М- FRT, компонента А и магнетизированной силики.

5. Внести в пробирки 900 мкл лизирующего раствора МАГНО-сорб.

6. Добавить в каждую пробирку с лизирующим раствором 200 мкл исследуемого образца плазмы и перемешать на вортексе.

7. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1 и ПК-2). Для этого в приготовленную пробирку ПКО-1 с лизирующим раствором добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-1-ВИЧ, а в приготовленную пробирку ПКО-2 с лизирующим раствором добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-2-ВИЧ, перемешать на вортексе.

8. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для этого в пробирку с лизирующим раствором добавить 100 мкл ОКО, перемешать на вортексе.

9. Поместить пробирки в термостат с температурой 60 °С на 10 мин.

10.На вортексе осадить капли жидкости с крышек и стенок пробирок, открыть крышки и перенести пробирки в магнитный штатив на 2 мин.

11.Осторожно, по внутренней стенке пробирки отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. Перенести пробирки в обычный штатив.

12.Добавить в пробирки по 700 мкл раствора для отмывки 5.

13.Перемешать магнетизированную силику вортексированием, а затем осадить капли кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).

14.Поставить пробирки в обычный штатив, открыть крышки и переставить в магнитный штатив. Инкубировать 2 мин.

15.Отобрать надосадочную жидкость и перенести пробирки в обычный штатив.

16.Повторить отмывку раствором для отмывки 5 (пп. 12-15).

17.Аналогично провести одну отмывку 700 мкл раствора для отмывки 6.

18.Добавить 200 мкл раствора для отмывки 7, перемешать, а затем осадить капли на вортексе. Поставить пробирки в обычный штатив и открыть крышки.

19.Переставить пробирки в магнитный штатив на 1 мин, затем отобрать надосадочную жидкость.

20.Высушить сорбент, оставив пробирки с открытыми крышками на магнитном штативе в течение 10 мин.

21.Добавить 50 мкл буфера для элюции и перемешать на вортексе.

22.Поместить пробирки в термостат при температуре 60 °С на 5 мин, через 2 мин перемешать на вортексе.

23.Коротко осадить капли на вортексе и переставить пробирки в магнитный штатив. Инкубировать 2 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенные РНК.

ВНИМАНИЕ! Отбор очищенных РНК для проведения реакции ОТ-ПЦР осуществляется не снимая пробирок с магнитного штатива.

РНК-пробы не рекомендуется хранить дольше 30 мин при температуре от 2 до 8 °С. Для длительного хранения препарата необходимо, не захватывая сорбент, перенести надосадочную жидкость в стерильную пробирку и хранить при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 мес или не выше минус 68 °С в течение года.

Г3. Экстракция нуклеиновых кислот с помощью автоматической станции (например, с помощью роботизированной станции для дозирования жидкостей Xiril (Xiril AG, Швейцария)

Комплект реагентов «МАГНО-сорб» совместим с открытыми автоматическими станциями выделения нуклеиновых кислот, использующими принцип намагничивания сорбента для эффективного отделения его от растворов, используемых в процессе экстракции. В этом случае, программирование протокола экстракции осуществляется по инструкции изготовителя автоматической станции в соответствии с последовательностью этапов, объемами реактивов и продолжительностью инкубаций, описанных выше в пп. Г1 и Г2 для комплекта реагентов «МАГНО-сорб».

ПРИЛОЖЕНИЕ Д. Порядок работы при использовании комплектов для экстракции РНК, не входящих в состав данного набора реагентов (при работе с формой 5)

Заявленные аналитические характеристики набора реагентов при работе с формой 5 гарантируются только в случае экстракции РНК при помощи комплектов реагентов рекомендованных ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (см. также методические рекомендации по применению набора реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT»).

В случае, если коэффициент В для используемого комплекта реагентов/автоматической станции для выделения нуклеиновых кислот не указан во вкладыше, прилагаемому к набору реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT», необходимо провести калибровку самостоятельно.

Калибровка необходима для определения коэффициента В и производится при первой постановке набора данной серии. Калибровка осуществляется один раз для каждой новой серии набора реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT» и проводится на используемом для экстракции РНК комплекте реагентов/автоматической станции.

Для про