Автоматическое растормаживание колес: Тормозные устройства колес предназначены для уменьшения длины пробега и улучшения маневрирования ВС при...
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим...
Топ:
Установка замедленного коксования: Чем выше температура и ниже давление, тем место разрыва углеродной цепи всё больше смещается к её концу и значительно возрастает...
Особенности труда и отдыха в условиях низких температур: К работам при низких температурах на открытом воздухе и в не отапливаемых помещениях допускаются лица не моложе 18 лет, прошедшие...
Эволюция кровеносной системы позвоночных животных: Биологическая эволюция – необратимый процесс исторического развития живой природы...
Интересное:
Влияние предпринимательской среды на эффективное функционирование предприятия: Предпринимательская среда – это совокупность внешних и внутренних факторов, оказывающих влияние на функционирование фирмы...
Средства для ингаляционного наркоза: Наркоз наступает в результате вдыхания (ингаляции) средств, которое осуществляют или с помощью маски...
Аура как энергетическое поле: многослойную ауру человека можно представить себе подобным...
Дисциплины:
2017-12-12 | 222 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Подвижность оц- и дц- нуклеиновых кислот,
зависимость от конформации (кольцо, супервитки), присутствия EtBr
Активно использовался перед Максамом-Гилбертом. Надо было разделить цепи перед введением метки.
Наносится на неденатуририрующий гель, но в момент нанесения полностью денатрурируется.
В большом объеме формамида растворяется дцДНК, нагревается до 95º, быстро охлаждается во льду и наносится на гель. Как только цепи в гель войдут, там будут конкурировать 2 процесса: ренатурация и локальные структуры, например, шпильки. Если нам повезет, и такие структуры будут разными, то и подвижность будет неодинакова. Если грубо, то если образовалась шпилька, то эффективная длина уменьшилась на длину этой шпильки.
Необходимо поддерживать низкую концентрацию при нанесении – очень толстый гель, очень длинный – 60 см, что очень неудобно.
Т = 4ºС. Чтобы отсрочить формирование дуплекса.
Подвижность дуплекса намного выше. Чуть ли не в 2 раза. Эффективная длина у него чуть-чуть побольше, а заряд в2 раза больше.
Электрофорез в денатурирующих условиях
Используется широко, причем и сейчас, только в другом формате, в капилляре.
Использовали для продуктов Сэнегера и Максама Гилберта. 35S, 32P, борьба за высокую разрешающую способность авторадиографии.
8М мочевина, формамид
Если хочется агарозы, анпример для крупной РНК, то не можем использовать и то, ни другое. Т.к. оба денатрурируют агарозу (нифига, кстати). Можем использовать щелочь.
Э/Ф в градиенте денатурирующего агента
Также м.б. в градиенте Т, т.к. это тоже денатурирующий агент
Еще называется гетеродуплексный анализ. Также для выявления SNP. Как метод скрининга этих замен – есть-нет.
|
С локуса получаем ампликон. Если есть полиморфизм у гетерозигот, после ПЦр будут нормальныедуплексы. Денатурируем и позволим снова ренатурировать, и наряду с нормальными дуплексами будет гетеродуплекс, т.к. чаще всего термодинамика мало отличается.
В геле существует градиент денатуранта, например, мочевины, концентраия ее по мере продвижения увеличивается. В начале небольшая, и ее недостаточно для денатрурации. Понятно, что подвижность дуплексов почти не отличается, и зарегистрировать напрямую не получится. Как только дуплексы достигают такого участка, что мочевины хватает для денатурации, они начинают двигаться в виде отдельных цепей. Дуплекс идеальныйрасплавится несколько позже, значит, у нас будет момент, когда гетеродуплекс уже расплавился, а гомо еще нет. А у дуплексов подвижность почти в 2 раза выше.
И этого сдвига достаточно для регистрации
Формировать гель с градиентом мочевины не очень удобно. Чаще используется термоградиент. А денатурирующего градиента добавляют немного.
Вариант на ту же тему – ионообменная хроматография.
Этим методом определяли происхождение Евы. (митохондриальная ДНК). А в Х-хромосоме искали хроматографией.
Афинный электрофорез
на примере электрофореза tRNA, имеющих сульфосодержащие основания
Гель содержит [(N-акрилоамино)фенил]ртуть:
Товарищам нужно было отделять модифицированные тРНК, содержащее серу, от немодифицированных. Молекулярная масса практически одинакова, заряд одинаковый.
Ввели в состав для гуппу, которая взаимодействует с атомами серы, и резко замедлять подвижность, в разы.
В состав геля можно включить практически любой лиганд.
Электрофорез на целлюлозе с неподвижными границами (изотахофорез в равновесии с эндоэлектроосмосом)
(Абелев Г.И. и др.)
Товарищи конструировали на заказ систему для фракционирования любых АГ, полипептидов. С прицелом на использование в медицинской практике.
|
Согласно второму условию, это д.б. изотахофорез. Но это неравновесный метод! Уйдет все в анодную камеру
Вспомнили про эндоэлектроосмос.
Взяли подложку, к которой пришиты ионогенный группы (пористая, бумага, например). И создали его в направлении, противоположном разделению компонентов в электрическом поле. Более того, в присутствии замыкающего электролита, осмос больше, чем в присутствии замыкающего.
Т.е. в начале осмос не большой, и общий вектор в направлении разделения. Но по мере движения границ осмос нарастает.
Осмотический поток зависит от количества молекул воды, которые движутся вместе с катионами. А в обратном направлении – вместе с катионами. Если с лидирующим анионом движется больше молекул воды, чем с замыкающим, то так и будет.
При правильном расчете осмотического потока, который можно регулировать с помощью ионогенных групп, пришитых к бумажке.
Один недостаток. Все компоненты непосредственно контактируют друг с другом – в виде зон.
Как бороться? Для антител – можно прогнать через бумажку с иммобилизованными антителами, и они свяжутся. Можно проявить таким способом.
Допустим, мы некоторые зоны нам надо разнести, а проявлять мы будем каим-то другим способом.
Можно добавить в разделяеую смесь спйсеры, электролиты в извесной концентрации, которые не будут взаимодействовать с компонентами, и у которых подвижность промежуточная. Шириной зоны мы можем управлять.Можем разнести компоненты на нужное расстояние.
Преимущества:
|
|
Типы оградительных сооружений в морском порту: По расположению оградительных сооружений в плане различают волноломы, обе оконечности...
Археология об основании Рима: Новые раскопки проясняют и такой острый дискуссионный вопрос, как дата самого возникновения Рима...
Семя – орган полового размножения и расселения растений: наружи у семян имеется плотный покров – кожура...
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ - конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!