Цель лекции – показать, что любой метод на самом деле шире, чем он есть

Приборы для э/ф

 

Электофорез в свободной системе постепенно возвращается. Э/ф в тонких трубках, конвекция перестает играть существенную роль и ей можно пренебречь. Можно использовать псевдогель, если нужно что-то, что обуслаливает матрикс, трение о которой обеспечит нам нужный параметр разделения.

 

Цель лекции – показать, что любой метод на самом деле шире, чем он есть

Специальные методы э/ф Белков

 

Белки – самый сложный БП на сегодня. Заряд не коррелирует с длиной и может сильно варьировать.

Изоэлектрическая точка – рН, при котором суммарный заряд равен 0.

Полезный параметр разделения

 

Использование исчерпывающей денатурации приводит к нормализации заряда.

Проводится взаимодействием с избытком денатурирующих агентов, детергентов типа SDS.

После денатурации белок напоминает НК: его заряд становится в некотором роде пропорциональным массе.

DISC электрофорез

на примере электрофореза белков в присутствии SDS по U. Laemmli

(модифицированная система буферов Орнштейна и Девиса)

 

Состоит из двух совершенно разных совмещенных систем.

 

Э/ф по Лэммли – самый цитируемый на сегодня. Хотя он самой системы не сделал, а просто предложил вести в денатурирующих условиях.

 

Препараты содержат очень много примесей, в т.ч. ионогенных и примесей других белков, и имеют большой объем.

Очищать их трудно и нежелательно

Был запрос – сделать систему, в которой бы сначала велось концентрирование проб. А непосредственное разделение никого не устраивали. Если объем большой, то ширина зоны изначально очень большая, и ионогенные примеси ее расширяют и искажают.

 

Давайте используем изотахофорез, каждый БП сконцентрируем в своей зоне. Добьемся такой концентрации, что от наличия ионогенных примесей уже не будет зависеть, и форма зоны будет идеальной.

А потом эти зоны нанесем на э/ф, на фоне однородного электролита.

 

А почему нас не усраивал изотахофорез? Зоны слишком плотно прилегают друг к другу, не разойдутся. Детектировать плохо, извлекать плохо.

 

Glycine: NH -CH -COOH,

pKa =2.34, pKa =9.6, pI=5.97

 

1 этап. Концентрирующий гель.

По сути нам не нужен, используется только для подавления конвекции.

Гель кА можно более низкой процентности.

Можно даже агарозный, но проблема с нагревм

Чаще ПААГ.

Лидирующий и замыкающий анион – 2 буфера

Для лидирующего используем хлор

С замыкающим проблема. Причем при переходе в другой гель замыкающий анион должен неожиданно увеличить подвижность и обогнать все разделяемые компоненты и убежать далеко вперед, чтобы э/ф шел на фоне этого замыкающего аниона

Делаем это просто, засчет изменения рН.

Используются глицин, например.

Пусть будет в геле рН 6.8.

Если рН сдвинем в кислую область и подавим протонирование глицина, то эффективный заряд его будет очень маленьким. И подвижность его будет соответствовать не самой маленькой частице, да еще и гидратированной, с зарядом 0.002е.

Концентрирующий гель д.б. такого объема, чтобы за время пребывания в нем система стала равновесной. Соответственно, чем больше мы наносим пробы и ем больше в ней ионогенных примесей, тем большую часть объема он должен занимать.

 

Этап. Разделяющий гель

Надо создать щелочную среду, чтобы резко увеличить подвижность глицина. Эффективный заряд увеличится на 2 прядка, засчет того, что заряд – логарифмическая величина.

Глицин обгонит все область БП.

Если посмотреть на свет, видны тонкие зоны – если много мажорного продукта

 

Разделение идет примерно по массе с поправкой на денатурацию.

 

 

Изоэлектрофокусирование (IEF)

 

Для разделения используется изоэлектричекая точка. (ИТ)

 

Если создадим градиент рН, и на фоне его создадим электрическое поле нужного напрвления, то создадим систему, в которой белки создадут стабильные зона в тех местах, где рН=ИТ. Зоны будут иметь резкие границы и будут стабиьными пока приложено ЭП.

В системе существуют силы, которые следят за тем, чтобы система оставалась равновесной, при попытке, например, с помощью диффузии, это состояние нарушить.

Одна проблема – создать градиент рН, да еще с достаточной буферной емкостью.

Белки – амфолины, и учавствуют в создании градиента тоже!

Чаще всего полипептиды и использубт для созданяградиента.

Сомое веселое, создать градиент рН можно с помощью того же изоэлектрического фокусирования.

В пределе ток будет маленьким и будет обусловлен только амфолинами, вышедшими из своих зон.

Надо только подобрать амфолины так, чтобы они перекрывали весь нужнй нам диапазон рН. Иначе сам белок будет этим самым амфолином и сформирует широкую зону, т.к. концентрация маленькая.

Недостаток – система нестабильна в пространстве и при небольших флуктуациях часть амфолинов может перейти в анодную или в катодную камеру.

Для подаления конвекции используется ПААГ небольшой процентности. Более того, иногда для этих целей используется бумага или вообще любая пористая структура, т.к. так же, как и изотахофорез, это процесс равновесный.

Чтобы зафиксировать в пространстве, используют иммобилизованные амфолины – гели или полоски пористого материала, изготовленные на заводе. В нужных местах уже ковалентно присоединены амфолины в нужном количестве.

Техническая проблема – отведение тепла.

Тонкий гель

Образцы можно наносить в любое место такой системы, т.к. все равно сформируется равновесное состояние, которое не зависит от исходного.

 

Эти 2 метода сейчас в эксперименте часто используются комбинированно.

Двумерный Э/Ф белков

 

Основа протеомики.

Сначала проводится изоэлектрофокусирование на тонкой полоске, а уже потом эта полоска используется как зона нанесения для ДИСК, заодно решается проблема концентрирования.

Типичный пример – разделение белков Е.соли.

 

 

СпециальныеЭ/Ф для НК

 

• постоянное отношение заряд / размер:
  Z ~= -N (-2N)
• малая зависимость заряда от pH
• денатурация:

применительно к НК – переход в одноцепочечную форму

o нагревание выше 65-70º C

o хаотропные агенты: (NH2)2CO, HCONH2

o pH > 9.5-10

Есть линейный участок в логарифмических координатах зависимости подвижности от длины.

 

Если речь идет о структурно других НК, например, кольцевых плазмид, да еще и замкнутых, то там подвижность может значительно меняться в зависимости от структуры.

Самая подвижная – суперскрученная, причем существенно. Засчет этого большая гибкость в любом месте. Стоит сбросить супервитки – еще меньше. А у линейной подвижность относительно релаксированной м.б. как больше, так и меньше. Зависит это от длины, от условий, от состава геля,

 

 

Афинный электрофорез

на примере электрофореза tRNA, имеющих сульфосодержащие основания

Гель содержит [(N-акрилоамино)фенил]ртуть:

 

Товарищам нужно было отделять модифицированные тРНК, содержащее серу, от немодифицированных. Молекулярная масса практически одинакова, заряд одинаковый.

Ввели в состав для гуппу, которая взаимодействует с атомами серы, и резко замедлять подвижность, в разы.

В состав геля можно включить практически любой лиганд.

 

 

Электрофорез на целлюлозе с неподвижными границами (изотахофорез в равновесии с эндоэлектроосмосом)
(Абелев Г.И. и др.)

Товарищи конструировали на заказ систему для фракционирования любых АГ, полипептидов. С прицелом на использование в медицинской практике.

• Должна быть равновесной: включил, ушел, пришел – ничего не выкипело и не сгорело. И все правильно и не искажено.
• Должна работать с биологическим материалом: слюна и т.д. Вносимые пробы могут иметь различный объем и состав, и это не должно было влиять на результат

Согласно второму условию, это д.б. изотахофорез. Но это неравновесный метод! Уйдет все в анодную камеру

Вспомнили про эндоэлектроосмос.

Взяли подложку, к которой пришиты ионогенный группы (пористая, бумага, например). И создали его в направлении, противоположном разделению компонентов в электрическом поле. Более того, в присутствии замыкающего электролита, осмос больше, чем в присутствии замыкающего.

Т.е. в начале осмос не большой, и общий вектор в направлении разделения. Но по мере движения границ осмос нарастает.

Осмотический поток зависит от количества молекул воды, которые движутся вместе с катионами. А в обратном направлении – вместе с катионами. Если с лидирующим анионом движется больше молекул воды, чем с замыкающим, то так и будет.

При правильном расчете осмотического потока, который можно регулировать с помощью ионогенных групп, пришитых к бумажке.

Один недостаток. Все компоненты непосредственно контактируют друг с другом – в виде зон.

Как бороться? Для антител – можно прогнать через бумажку с иммобилизованными антителами, и они свяжутся. Можно проявить таким способом.

 

Допустим, мы некоторые зоны нам надо разнести, а проявлять мы будем каим-то другим способом.

Можно добавить в разделяеую смесь спйсеры, электролиты в извесной концентрации, которые не будут взаимодействовать с компонентами, и у которых подвижность промежуточная. Шириной зоны мы можем управлять.Можем разнести компоненты на нужное расстояние.

 

Преимущества:

1. концентрирование проб, независимость результата от объема нанесения
2. независимость результата от времени ведения процесса
3. возможность легкой адаптации к самым разным задачам (разделяемым смесям)

 

 

Э/ф в псевдогеле. НК

 

"ГЕННЫЙ АНАЛИЗАТОР" ABI 310
(Applera = Applied Biosystems+Сelera Genomics)

 

Принцип тот же, трение о матрикс. Только гель не совсем честный, иначе мы его ни за что из капилляра не вытряхнем, а одноразовые капилляры – дорого.

Используется псевдогель, модифицированный линейный ПАА. Есть боковые группы, которые создают виртуальный гель засчет нековалентных взаимодействий. Начинает приближаться к агарозе. Этакий жидкий кристалл. Но никто не проверял. Хотя хорошо отфильтрованный линейный ПАА, в узком диапазоне длин, тоже работает.

Позволяет разделять продукты реакции Сенгера. Или просто разделять фрагменты – ГенСкан.

При разделении некоторые фрагменты имеют разную массу, но одинаковую подвижность – просто у флюорохромов разные заряды. Даже сдвигают подвижность до 1 звена.

Современные приборы – до 16 капилляры.

 

 

Приборы для э/ф

 

Электофорез в свободной системе постепенно возвращается. Э/ф в тонких трубках, конвекция перестает играть существенную роль и ей можно пренебречь. Можно использовать псевдогель, если нужно что-то, что обуслаливает матрикс, трение о которой обеспечит нам нужный параметр разделения.

 

Цель лекции – показать, что любой метод на самом деле шире, чем он есть