Специальные методы э/ф Белков

 

Белки – самый сложный БП на сегодня. Заряд не коррелирует с длиной и может сильно варьировать.

Изоэлектрическая точка – рН, при котором суммарный заряд равен 0.

Полезный параметр разделения

 

Использование исчерпывающей денатурации приводит к нормализации заряда.

Проводится взаимодействием с избытком денатурирующих агентов, детергентов типа SDS.

После денатурации белок напоминает НК: его заряд становится в некотором роде пропорциональным массе.

DISC электрофорез

на примере электрофореза белков в присутствии SDS по U. Laemmli

(модифицированная система буферов Орнштейна и Девиса)

 

Состоит из двух совершенно разных совмещенных систем.

 

Э/ф по Лэммли – самый цитируемый на сегодня. Хотя он самой системы не сделал, а просто предложил вести в денатурирующих условиях.

 

Препараты содержат очень много примесей, в т.ч. ионогенных и примесей других белков, и имеют большой объем.

Очищать их трудно и нежелательно

Был запрос – сделать систему, в которой бы сначала велось концентрирование проб. А непосредственное разделение никого не устраивали. Если объем большой, то ширина зоны изначально очень большая, и ионогенные примеси ее расширяют и искажают.

 

Давайте используем изотахофорез, каждый БП сконцентрируем в своей зоне. Добьемся такой концентрации, что от наличия ионогенных примесей уже не будет зависеть, и форма зоны будет идеальной.

А потом эти зоны нанесем на э/ф, на фоне однородного электролита.

 

А почему нас не усраивал изотахофорез? Зоны слишком плотно прилегают друг к другу, не разойдутся. Детектировать плохо, извлекать плохо.

 

Glycine: NH -CH -COOH,

pKa =2.34, pKa =9.6, pI=5.97

 

1 этап. Концентрирующий гель.

По сути нам не нужен, используется только для подавления конвекции.

Гель кА можно более низкой процентности.

Можно даже агарозный, но проблема с нагревм

Чаще ПААГ.

Лидирующий и замыкающий анион – 2 буфера

Для лидирующего используем хлор

С замыкающим проблема. Причем при переходе в другой гель замыкающий анион должен неожиданно увеличить подвижность и обогнать все разделяемые компоненты и убежать далеко вперед, чтобы э/ф шел на фоне этого замыкающего аниона

Делаем это просто, засчет изменения рН.

Используются глицин, например.

Пусть будет в геле рН 6.8.

Если рН сдвинем в кислую область и подавим протонирование глицина, то эффективный заряд его будет очень маленьким. И подвижность его будет соответствовать не самой маленькой частице, да еще и гидратированной, с зарядом 0.002е.

Концентрирующий гель д.б. такого объема, чтобы за время пребывания в нем система стала равновесной. Соответственно, чем больше мы наносим пробы и ем больше в ней ионогенных примесей, тем большую часть объема он должен занимать.

 

Этап. Разделяющий гель

Надо создать щелочную среду, чтобы резко увеличить подвижность глицина. Эффективный заряд увеличится на 2 прядка, засчет того, что заряд – логарифмическая величина.

Глицин обгонит все область БП.

Если посмотреть на свет, видны тонкие зоны – если много мажорного продукта

 

Разделение идет примерно по массе с поправкой на денатурацию.

 

 

Изоэлектрофокусирование (IEF)

 

Для разделения используется изоэлектричекая точка. (ИТ)

 

Если создадим градиент рН, и на фоне его создадим электрическое поле нужного напрвления, то создадим систему, в которой белки создадут стабильные зона в тех местах, где рН=ИТ. Зоны будут иметь резкие границы и будут стабиьными пока приложено ЭП.

В системе существуют силы, которые следят за тем, чтобы система оставалась равновесной, при попытке, например, с помощью диффузии, это состояние нарушить.

Одна проблема – создать градиент рН, да еще с достаточной буферной емкостью.

Белки – амфолины, и учавствуют в создании градиента тоже!

Чаще всего полипептиды и использубт для созданяградиента.

Сомое веселое, создать градиент рН можно с помощью того же изоэлектрического фокусирования.

В пределе ток будет маленьким и будет обусловлен только амфолинами, вышедшими из своих зон.

Надо только подобрать амфолины так, чтобы они перекрывали весь нужнй нам диапазон рН. Иначе сам белок будет этим самым амфолином и сформирует широкую зону, т.к. концентрация маленькая.

Недостаток – система нестабильна в пространстве и при небольших флуктуациях часть амфолинов может перейти в анодную или в катодную камеру.

Для подаления конвекции используется ПААГ небольшой процентности. Более того, иногда для этих целей используется бумага или вообще любая пористая структура, т.к. так же, как и изотахофорез, это процесс равновесный.

Чтобы зафиксировать в пространстве, используют иммобилизованные амфолины – гели или полоски пористого материала, изготовленные на заводе. В нужных местах уже ковалентно присоединены амфолины в нужном количестве.

Техническая проблема – отведение тепла.

Тонкий гель

Образцы можно наносить в любое место такой системы, т.к. все равно сформируется равновесное состояние, которое не зависит от исходного.

 

Эти 2 метода сейчас в эксперименте часто используются комбинированно.

Двумерный Э/Ф белков

 

Основа протеомики.

Сначала проводится изоэлектрофокусирование на тонкой полоске, а уже потом эта полоска используется как зона нанесения для ДИСК, заодно решается проблема концентрирования.

Типичный пример – разделение белков Е.соли.

 

 

СпециальныеЭ/Ф для НК

 

• постоянное отношение заряд / размер:
  Z ~= -N (-2N)
• малая зависимость заряда от pH
• денатурация:

применительно к НК – переход в одноцепочечную форму

o нагревание выше 65-70º C

o хаотропные агенты: (NH2)2CO, HCONH2

o pH > 9.5-10

Есть линейный участок в логарифмических координатах зависимости подвижности от длины.

 

Если речь идет о структурно других НК, например, кольцевых плазмид, да еще и замкнутых, то там подвижность может значительно меняться в зависимости от структуры.

Самая подвижная – суперскрученная, причем существенно. Засчет этого большая гибкость в любом месте. Стоит сбросить супервитки – еще меньше. А у линейной подвижность относительно релаксированной м.б. как больше, так и меньше. Зависит это от длины, от условий, от состава геля,