Тема: Определение активности пероксидазы в слюне по Попову

Цель: Исследовать защитные функции пероксидазы слюны. В физиологических условиях полости рта патогенные факторы нейтрализуются защитными факторами, к числу которых относятся специфические иммуноглобулины и пероксидазы. Пероксидазы – ферменты класса оксидоредуктаз – катализируют окисление различных веществ в присутствии Н₂О₂, который действует как акцептор водорода и превращается в воду.

Принцип метода: В присутствии перекиси водорода пероксидаза окисляет индигокармин, который при этом обесцвечивается.

Ход работы: Готовят два образца, согласно таблице:

Таблица Приготовление образцов

Реактивы	Образец 1	Образец 2
	Опыт	Контроль
Ацетатный буфер, мл	0,5	0,5
Индигокармин, мл	0,5	0,5
Слюна, мл	0,25	-

Образцы помещают в термостат и инкубируют при температуре 30ºС в течение 5 мин. По окончании инкубации в опытный образец вносят 0,25 мл раствора перекиси водорода, а в контрольный – 0,5мл дистиллированной воды. Включают секундомер и останавливают реакцию через 2мин после добавления в оба образца по 1,5мл 20%-го раствора серной кислоты. Образцы интенсивно встряхивают. Определяют оптическую плотность образцов на фотоэлектроколориметре в кюветах толщиной 1см при длине волны 610 нм против дистиллированной воды.

Активность пероксидазы рассчитывают по формуле:

где, А – активность пероксидазы, мкмоль/мин∙л;

Е_к – оптическая плотность контроля;

Е_о – оптическая плотность образца;

1142,9 – расчетный коэффициент, полученный на основе формулы Вебера и Рихтериха.

Расчет:

Вывод:

Дата:                                                        Подпись преподавателя:

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 6

Тема: Определение активности щелочной фосфатазы в слюне

Цель:Оценить активность щелочной фосфатазы в составе слюны.Щелочная фосфатаза обладает свойством освобождать неорганический фосфат из органических соединений. Этот фосфат взаимодействует с кальцием, образуются соли, которые откладываются там, где действует фермент (гипотеза Робисона). Солевой состав крови, кости, слюны и твердых тканей зуба находится в равновесии, а фермент – щелочная фосфатаза - вызывает перенасыщение, необходимое для осаждения минеральных солей.

Принцип метода: Определение активности щелочной фосфатазы (ЩФ) основывается на гидролизе n-нитрофенилфосфата натриевой соли (n-НФФNа₂) ферментом с образованием эквимолярного количества n-нитрофенола, окрашенного в щелочной среде в желтый цвет. Интенсивность окраски раствора пропорциональна активности ЩФ и определяется фотометрически.

Меры предосторожности:

В состав набора входит щелочной раствор АМП – буфера. При попадании его на кожу и слизистые следует промыть пораженное место большим количеством проточной воды.

Проведение анализа

Кинетический метод:

В кювету внести 1 мл рабочего реагента, инкубировать 10 мин при 37°С, затем добавить 0,02 мл слюны и перемешать. Через 90 сек измерить оптическую плотность (Е₁). Через 90 сек повторить измерение (Е₂). Длина волны 405 (400 – 425) нм, кювета с длиной оптического пути 3мм, раствор сравнения – рабочий реагент.

Активность (А) ЩФ ( Ед/л) рассчитывается по формуле:

где Е = Е₂ – Е₁ – изменение оптической плотности в опытной пробе.

Нормальные величины 36 – 120 Ед/л

Расчет:

Вывод:

Дата:                                                        Подпись преподавателя:

Вопросы к контрольной работе по теме: Коферментные функции витаминов. Ферменты слюны и ротовой жидкости

1. Укажите оптимум действия ферментов: амилазы, липазы, пепсина, трипсина.

2. Перечислите виды специфичности. Приведите пример абсолютной и относительной специфичности.

3. Влияние неспецифических факторов на активность фермента (Т, рН и т.д.).

4. Что такое проферменты и изоферменты. Приведите примеры.

5. Какие реакции ускоряют эстеразы, пептидазы, гликозидазы, фосфатазы? К какому классу ферментов они относятся? Какой вид специфичности характерен для этих ферментов?

6. К какому классу относятся и какова функция ферментов: дегидрогеназ, редуктаз, флавиновые ферменты, цитохромы, аминотрансферазы, киназы, декарбоксилазы, карбоксилазы. Какие коферменты входят в состав этих ферментов?

7. К какому классу ферментов относятся ферменты пищеварительного тракта?

8. Что называется энергетическим барьером реакции? Что такое энергия активации? Что понимают под «активированным состоянием»?

9. Какие факторы влияют на скорость ферментативной реакции? Какова структура регуляторных ферментов?

10. Каким образом влияют на активность ферментов структурные аналоги субстратов?

11. Типы обратимого ингибирования ферментов. Охарактеризуйте каждый вид обратимого ингибирования, приведите примеры.

12. Примеры использования ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов.

13. Что понимают под энзимопатологией? Приведите примеры энзимопатий, охарактеризуйте их.

14. Что понимают под энзимодиагностикой? В каких объектах определяют активность ферментов с целью диагностики заболеваний?

15. Что понимают под энзимотерапией? Назовите препараты, используемые для энзимотерапии.

16. Суть коферментной функции витаминов. Биологические функции кофермента, образованного из витамина В₁, В₂, В₆, РР (В₅).

17. На каких свойствах аскорбиновой кислоты основано ее участие в обменных процессах? Назовите вещества, в синтезе которых участвует аскорбиновая кислота.

18. Какие компоненты слюны выполняют защитную функцию?

19. Какова роль ферментов слюны в минерализации твердых тканей зуба?

20. При каких условиях слюна становится деминерализующей жидкостью?

21. Какую роль выполняют нитраты и нитриты в составе слюны?

22. Какие регуляторные вещества входят в состав слюны?

23. Каковы функции слюнных желез?

24. Антигенспецифические вещества слюны

25. В чем заключается роль кислой и щелочной фосфатаз в процессе минерализации твердых тканей зуба?

26. Какие ферменты участвуют в деструкции пародонта? Как регулируется их активность?

27. Какова роль пищеварительных ферментов, содержащихся в слюне? Каковы их оптимальные рН?

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ 5