Матричный участок. Взаимодействие TER с ДНК-праймером.

Обычно длина матричного участка TER примерно равна длине

полу тора копий теломерного повтора, но может быть длиннее или

короче [26]. Сам матричный участок в TER и его границы определяет

вторичная структура TER. На 3'-конце этого участка находится участок

отжига праймера, а на 5'-конце – граничный элемент, отделяю щий

матричный участок от остальной части молекулы. У TER T. ter mophila

описан также элемент TRE [113], который служит для узна вания

матричного участка TER каталитической субъединицей TERT.

Матричный участок играет важную роль в катализе. Некоторые

мута ции в нем могут приводить к значительному изменению

актив ности фермента in vivo и in vitro. Тринуклеотидные замены в

различных местах матричного участка TLC1 РНК снижают актив-

ность фермента, иногда вплоть до полной ее потери. Обнаружена

также мутация, вызывающая «проскальзывание» по матрице при

удли нении праймера [38]. Точечные замены в матричном участке

TER T. termophila приводят к неточному встраиванию нуклеотидов

и к ранней диссоциации праймера.

Следует отметить, что в некоторых случаях мутации в матрич-

ном участке TER не влияют на активность фермента. Так, при

замене всего матричного участка TER T. termophila активность тело-

ме разы сохраняется, но теряется ее процессивность in vitro [114].

Предполагают, что нуклеотид-специфичные взаимодействия TERTERT

в области матрицы не обязательны для способности теломеразы

T. termophila удлинять праймер в пределах одного теломерного пов-

тора. Если же вместо РНК-матрицы использовать ДНК-матрицу, то

можно получить непроцессивную теломеразу с очень низкой эффек-

тив ностью удлинения праймера [115].

При замене матричного участка в TLC1 РНК на матричный учас-

ток TER человека в теломерах обнаруживаются гомогенные повторы,

соответствующие новой матрице. Следовательно, можно предполагать,

Теломераза: компоненты и функции, регуляторы фермента 177

что за гетерогенность теломерных повторов в хромосомах дрож жей

отвечает последовательность нуклеотидов матрицы в TLC1 РНК, на

которой возможны различные варианты отжига праймера при свя зы-

ва нии его для удлинения [30].

Интересна роль последовательности нуклеотидов в участке отжига

тело мерного праймера в проявлении ферментом процессивности [32,

111]. Теломераза человека, у которой этот участок длиннее (5 н.),

чем у теломеразы мыши (2 н.), процессивна по второму типу in

vitro, в отличие от непроцессивной теломеразы мыши. Это различие

объяс няют эффективностью отжига праймера при транслокации:

после довательность в участке отжига праймера должна совпадать с

5'-концевой последовательностью матричного участка [29]. Однако

процессивность определяется не только участком отжига праймера.

Так, например, в теломеразе дрожжей этот участок достаточно протя-

женный (5 н.), но фермент не проявляет процессивности по второму

типу in vitro [29].

Кажется вполне вероятным, что длина дуплексного участка

между матрицей и праймером возрастает по мере присоединения

нук лео тидов к праймеру, однако это предположение опровергается

рядом работ. У теломераз E. aediculatus и человека [73] отсутствует

корре ля ция между числом пар оснований дуплекса, который прай-

мер потенциально способен образовать с матричным участком, и

эффек тив ностью его связывания ферментом. С помощью метода

хими ческого тестирования матричного участка TLC1 РНК показано,

что в теломеразе дрожжей при удлинении праймера число спаренных

осно ваний между субстратом и матричным участком РНК остается

пос тоянным и равным семи [88]. При этом, по ходу процесса удли не-

ния новые пары образуются с 3'-конца праймера, а с 5'-конца проис-

хо дит расплетание цепей.

Для теломеразы человека установлена зависимость взаимодейст-

вия праймера с теломеразой от его положения на матрице при отжиге

[73]. Предполагают, что это связано с взаимодействием 3'-конца

праймера с TERT.

5'-граничный элемент. Этот элемент в структуре TER тормозит уд-

ли нение праймера дальше определенного района матричного участка.

Он представляет собой спираль, ограничивающую одноцепочечный

участок (теломеразы дрожжей [109, 116] и человека [132]) или специ-

фи ческую последовательность (теломераза простейших [84]).

Сходны ли механизмы действия 5'-граничных элементов TER в раз-

личных организмах? У простейших этот элемент представляет собой

специфическую нуклеотидную последовательность, эффективно

178 М. Э. Зверева и соавт.

связы вающую TERT, у дрожжей и млекопитающих – это стебель

и шпилька во вторичной структуре РНК [116, 117]. 5'-граничный

эле мент дрожжей связывает TERT и непосредственно примыкает к

мат ричному участку. Возможно, у простейших, дрожжей и млекопи-

тающих механизм действия 5'-граничного элемента различен. Эта

структура ограничивает движение матричного участка TER в актив-

ном центре теломеразы простейших в результате РНК-белковых

взаимо действий. Такое движение матричного участка необходимо при

удли нении праймера, так как при добавлении каждого нуклеотида

положение матрицы относительно активного центра должно изме-

няться. В теломеразе человека движение матричного участка TER

ограничено за счет РНК–РНК взаимодействий во вторичной струк-

туре. Предполагается, что в теломеразе дрожжей 5'-граничный

элемент ограничивает не только движение РНК, но и доступность

одно цепочечного участка, так как стебель шпильки 5'-граничного

эле мента в TER примыкает непосредственно к матрице.

Недавно была обнаружена и охарактеризована TER дрожжей

Schizosaccharomyces pombe – TER1 [118, 119]. Эта РНК длиной 1213

н.о., независимо взаимодействует с SpEst1 и SpEst2 (ортологи Est1p

и Est2p S. cerevisiae). Был проанализирован 5'-граничный элемент

этой РНК. Как и для теломеразы S. cerevisiae важной оказалась не

нуклеотидная последовательность этого участка, а образование

им двухцепочечной спирали РНК, механически препятствующей

даль нейшему удлинению праймера. Однако, оказалось, что часть

спа ренного района в спирали включает в себя участок матрицы, то

есть 5'-граничный элемент, представляющий собой двухспиральную

РНК, который при удлинении должен частично расплетаться. С этой

особенностью связывают гетерогенность теломерных повторов неко-

то рых дрожжей.

Псевдоузел в структуре TER. Взаимодействие TER с TERT.

Псе вдоузел во вторичной структуре TER различных организмов

распо ложен одинаково по отношению к матричному участку [45].

Выяс нено, что для функционирования теломераз важна не только

вто ричная структура TER, но и нуклеотидная последовательность

высо коконсервативных участков в псевдоузле, в том числе, и одноце-

почечных [45, 109, 120].

В последнее время появилось несколько работ, в которых сооб-

ща лось об установлении третичной структуры некоторых элементов

TER простейших и человека.

В центральном домене TER человека спирали Р2b и Р3, а также

петли J2b/3 и J2a/3 образуют псевдоузел. Третичная структура псевдо-

Теломераза: компоненты и функции, регуляторы фермента 179

узла в центральном домене TER и ее соответствие эксперименталь-

ным данным, полученным на основе мутагенеза, впервые были непос-

редственно установлены в 2005 году для теломеразы человека [121].

Структурный и мутационный анализы свидетельствовали о нали чии

тройной спирали в этой области. Теломеразная активность нахо дится

в строгой корреляции со стабильностью тройной спирали. При этом,

если одни данные свидетельствуют в пользу динамичной струк туры

псевдоузла [122], то другие – говорят о ее статичности [120].

Недавно и для TLC1 РНК дрожжей S. cerevisiae было показано

обра зование тройной спирали в центральном домене [110]. Наруше ние

этой структуры приводило к уменьшению теломеразной активности

in vitro и укорочению теломер in vivo. При этом связывание с Est2p

не изменялось. Было высказано предположение, получившее экспери-

ментальное подтверждение, что тройная спираль важна не для

связывания Est2p, а участвует в катализе за счет ориентации спирали

матрица-праймер с помощью 2′-OH групп. Было показано подобное

участие в катализе псевдоузла в теломеразной РНК человека. Роль

струк туры тройной спирали не ограничивается только катализом,

гораздо более важную функцию она выполняет в качестве структуры,

сближающей дуплекс матричного участка и праймера с активным

центром TERT.

В теломеразной РНК дрожжей S. cerevisiae и K. lactis псевдоузел

участвует во взаимодействии с каталитической белковой субъедини-

цей. В TER млекопитающих для связывания TERT и функционирова-

ния теломеразы in vivo и in vitro нужны не только псевдоузел, но и

дру гая консервативная структура в удаленном от псевдоузла участке –

шпилька Р6.1 высококонсервативного домена CR4-CR5. Аналогичной

структуры в TLC1 РНК не найдено. Домен CR4-CR5 вместе со

шпилькой P6.1 относят к так называемым «транс-активирующим

доменам».

В третичной структуре домена CR4-CR5 было установлено рас-

по ложение спиралей P6a и P6b, а также петли J6 между ними [123].

Важнейшая для функционирования теломеразы шпилька P6.1 содер-

жит на конце петли три нуклеотида, остатки оснований которых экс-

по нированы в раствор. Химическое тестирование их структуры in

vivo показал, что они недоступны для модификации. Это позволяет

пред положить, что они вовлечены во взаимодействия с белком или

с РНК.

В TER млекопитающих [120, 124] и простейших псевдоузел во

вто рич ной структуре необходим для процессивности при удлинении

прай мера, причем в случае теломеразы простейших, важен не только

180 М. Э. Зверева и соавт.

псевдоузел, но и шпилька IV. Интересно, что замена псевдоузла в

TER человека на аналогичную структуру из теломеразы T. termophila

при во дит к образованию непроцессивного in vitro фермента с низкой

активностью. Предполагается, что такая замена нарушает взаимо дей-

ствие удаленной шпильки Р6.1 со структурой псевдоузла, а, возможно,

и с TERT.

С помощью ЯМР-спектроскопии коротких аналогов TER простей-

ших удалось определить структуру шпилек II и IV [125, 126]. В

шпильке II для функционирования теломеразы и ограничения синтеза

по матрице для связывания TERT необходимо самое основание

шпильки, конец же шпильки не важен для активности. Шпилька IV

необ ходима для взаимодействия с TERT, вспомогательным белком

р65 и для проявления ферментом процессивности [112, 127, 128].

Шпильку IV относят к транс-активирующим доменам TERT; за счет

неспа ренного выпетливания GA она формирует сильно изогнутую

структуру [125, 126].