II. Структура и функция теломеразы

Как уже указывалось, теломераза – это особая обратная транскрип-

таза, работающая в комплексе со специальной теломеразной РНК.

Субстратами теломеразы в реакции являются дезоксинуклеотид-5'-

трифосфаты и 3'-конец теломеры (в тестах in vitro это ДНК-оли го-

нук леотид, с последовательностью, соответствующей теломерным

повторам хромосом). Особое свойство, отличающие теломеразу от

других РНК-зависимых ДНК-полимераз, состоит в использовании

фиксированного участка специальной РНК (называемой теломераз-

ной) в качестве матрицы для удлинения теломеры. Теломеразная

РНК взаимодействует с теломерой не только на этом матричном

участке, но и дополнительно в так называемом «якорном сайте». Тело-

мераза может добавлять несколько теломерных повторов за один акт

присоединения к олигонуклеотидному субстрату [25].

160 М. Э. Зверева и соавт.

Цикл реакций теломеразы in vitro (рис. 2) включает следующие

стадии: связывание праймера, элонгацию, транслокацию, и диссо-

циа цию. При последовательном переходе фермента из состояния

(1) через состояния (2) и (3) в состояние (4) теломераза добавляет к

праймеру один теломерный повтор. Переход (4) – (2) соответствует

транс локации II, т.е. добавлению нескольких теломерных повторов

без отделения от праймера (переход (4) – (1) на рис. 2.

На этом рисунке отражены процессы транслокации I и II. Спо-

соб ность к транслокации связана с процессивностью фермента.

Выделяют два типа процессивности теломеразы [26]. Процессив ность

I – способность теломеразы к транслокации дуплекса РНК–ДНК в

актив ном центре после присоединения каждого нуклеотида на стадии

элонгации. Процессивность II – ее способность к транслокации отно-

сительно связанного ДНК-праймера после присоединения одного

Рис. 2. Реакционный цикл теломеразы.

TERT – каталитическая субъединица (серым кружком показан якорный сайт),

TER – теломеразная РНК с матричным участком (серый прямоугольник).

Цифры в рамке обозначают положение теломеразы по отношению к прай меру

на различных стадиях: 1 – фермент не связан с праймером; 2 – отжиг праймера;

3 – стадия элонгации; 4 – завершение присоединения одного теломерного пов-

тора. Пунктирными стрелками показаны возможные процессы диссоциации

праймера при работе фермента.

Теломераза: компоненты и функции, регуляторы фермента 161

теломерного повтора, в результате чего праймер вновь приобретает

способность удлиняться (переход (4) – (2) на рис. 2). Два типа

процессивности принципиально различаются между собой. Если в

первом случае происходит одновременная транслокация дуплекса

РНК–ДНК относительно активного центра фермента, то во втором –

3'-конец ДНК должен изменить свое положение относительно РНК-

матрицы.

Эффективность прохождения стадий транслокации I и II в реак-

ции in vitro у теломераз из разных организмов различается и может

варьировать в зависимости от условий получения фракции с тело ме-

разной активностью [27–29].

Теломераза дрожжей in vitro делает паузы и останавливает

нара щивание праймера после присоединения каждого нуклеотида.

Таким образом, можно говорить о неэффективной транслокации

I и отсутствии транслокации II. С особенностью процессивности

первого типа связывают наблюдаемую гетерогенность добавляемых

теломеразой повторов в теломерах дрожжей S. cerevisiae [30].

Теломеразы человека и простейших процессивны по второму типу

in vitro. Они способны добавлять сотни нуклеотидов к теломерному

субстрату, многократно достраивая теломерные повторы по своей

РНК-матрице [31, 32]. Теломеразы ряда других организмов, таких как

мышь [33], различные дрожжи [34, 35], не процессивны по второму

типу in vitro. Для теломеразы дрожжей S. cerevisiae показано, что,

удлинив теломерный праймер, теломераза остается связанной со

своим субстратом [36]. В то же время in vivo эта теломераза способна

добавлять к теломере более 100 нуклеотидов за один клеточный

цикл [37]. Это противоречие можно объяснить тем, что in vivo фер-

мент процессивен по второму типу, или тем, что происходит непро-

цес сивное удлинение, в результате которого фермент много раз

дис социирует и затем ассоциирует с теломерой вновь для нового

удлинения.

Показано, что теломераза дрожжей способна удлинять праймеры с

нетеломерной последовательностью в районе 4–6 н. от 3'-конца более

чем на один теломерный повтор. При этом фермент не добавляет

нес колько теломерных повторов, как обладающие процессивностью

второго типа теломеразы человека и простейших, а проскальзывает

дальше по матрице [38].

Однако существует и другое мнение о различии в процессивности

теломераз дрожжей и других организмов. Предполагается, что разли-

чие в процессивности между теломеразами носит не качественный,

а количественный характер [39].

162 М. Э. Зверева и соавт.

Для изучения процессивности теломеразы дрожжей in vivo и

меха низма того, каким способом теломераза эффективно удлиняет

самые короткие теломеры, Чанг с соав. [40] создали специальную

сис тему. При экспрессировании одновременно теломеразной РНК

дикого типа и РНК с мутированным матричным участком, следили за

удли нением теломер в одном раунде клеточного цикла. Теломерные

повторы, встраиваемые при участии двух типов теломеразной РНК

были различимы, и по частоте их встраивания можно делать выводы

о характере работы теломеразы. Было обнаружено, что теломераза в

сред нем не процессивна. Однако, на самых коротких теломерах было

обнаружено процессивное удлинение, которое оказалось зависимым

от ортолога ATM млекопитающих, Tel1p киназы.

В дополнение к процессам, показанным на рис. 2, нужно добавить,

что у теломераз дрожжей [41, 42], простейших [27] и человека [43, 44]

обна ружена ассоциированная с этим ферментом нуклеазная активность.

ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ТЕЛОМЕРАЗНОГО КОМПЛЕКСА

Теломеразная РНК (TER – telomerase RNA) содержит матричный учас-

ток и другие функционально важные элементы вторичной структуры,

участвующие в ограничении матричного участка, связывании белко-

вой субъединицы, а также частично выполняющие каталитические

и другие функции [2, 45]. Теломеразная обратная транскриптаза

(TERT – telomerase reverse transcriptase) содержит каталитически

важ ный домен, напоминающий домен обратных транскриптаз, а

также домены, характерные только для теломераз, необходимые

для связывания TER, ДНК-субстрата, функциональной активности

тело ме разы [2, 46]. TER и TERT образуют коровый фермент. Этих

компонентов достаточно для обеспечения функциональной актив-

ности теломеразы in vitro. Для функционирования in vivo необхо-

димы вспомогательные белки, часть которых входит в состав холо-

фер мента. Несмотря на большой интерес к теломеразе и важность

ее изучения в прикладном аспекте, структурные данные о TERT,

TER и других теломеразных белках стали появляться относительно

недавно из-за сложности изучения теломеразы (чрезвычайно низкое

содер жание фермента в клетке, трудность получения ее компонентов

в растворимой форме и в достаточном количестве и др.). В этом

разделе, посвященном TER и TERT, основное внимание уделено

новым результатам, полученным в последние годы.

Теломераза: компоненты и функции, регуляторы фермента 163

Теломеразная обратная транскриптаза (TERT)

Доменная структура. Каталитические субъединицы теломераз имеют

аминокислотную последовательность, сходную с последователь-

ностью обратных транскриптаз. В вирусных обратных транскрипта-

зах и теломеразах установлена консервативность аминокислотных

остатков (а. о.), отвечающих за катализ, связывание нуклеотидов,

рас поз навание рибо- и дезоксинуклеотидов [25].

Обратно-транскриптазный домен TERT отличается от соот ветст-

вующего домена обратных транскриптаз тем, что между консерва тив-

ными для обратных транскриптаз мотивами A и B' находится участок

IFD (рис. 3). Этот участок важен для функционирования теломеразы

дрожжей in vivo. Мутации в нем приводят к снижению активности

фер мента in vitro [47].

Поиск функционально значимых участков в первичной структуре

белка и выделение в них а. о., при замене которых нарушается то или

иное свойство теломеразы, в большинстве работ [48–50] проведены

на основе гомологии между TERT различных организмов. Подходы,

не использующие гомологию (например, «метод эволюции одного

гена» [51]), привели к сходным результатам.

Функциональные домены белка и участки в них получили раз-

ные названия. В целом, в структуре TERT можно выделить четыре

функциональных домена: 1) N-концевой домен, содержащий уме-

ренно консервативный GQ-блок (гипомутабельный домен І сог ласно

классификации [51]), который в последнее время называют TEN-до-

меном [52]; 2) РНК-связывающий домен (TRBD-домен) с консер ва-

тивными мотивами CP, QFP и T (гипомутабельные домены ІІ, ІІІ и

ІV); 3) обратно-транскриптазный домен (RT-домен), содержащий семь

консервативных мотивов и IFD-участок; 4) низкоконсервативный

C-кон цевой домен (CTE – домен).

Получить TERT в растворимой форме в количестве, достаточном

для кристаллизации – довольно сложная задача, что затрудняет струк-

тур ные исследования этого белка. Поэтому структурных данных о

белке TERT пока немного. Данные о структурной организации всего

Рис. 3. Доменная структура TERT.

164 М. Э. Зверева и соавт.

комплекса вообще отсутствуют. В последнее время был достигнут

боль шой прогресс в изучении TERT, так как появились структуры,

полу ченные с помощью рентгеноструктурного анализа, отдельных

доменов TERT [52, 53], а также всей молекулы TERT, не включающий

в себя TEN-домен [54]. Тщательные биохимические исследования

в сочетании с направленным мутагенезом, которые проводились с

учетом новых полученных данных о структуре, значительно расши-

рили представления о механизме функционирования TERT [39, 55].

Удалось закристаллизовать каталитическую субъединицу красного

мучного жука Tribolium castaneum, геном которого был недавно секве-

нирован [56]. TERT T. castaneum не содержит TEN-домена. Остальные

домены (TRBD, RT, CTE) образуют кольцо. Мотивы, вовлеченные

в свя зывание субстрата и катализ, расположены внутри кольца. В

кольце могут располагаться 7–8 пар оснований РНК–ДНК дуплекса.

Вся структура имеет много общего со структурами ретровирусных

обрат ных транскриптаз, вирусных РНК-полимераз и ДНК-полимераз

B-семейства [54].

Различия в структуре различных TERT касаются, в основном, N- и

С-концевых участков. Эти сведения представляются особенно инте рес-

ными, так как в концевых районах не наблюдается значительной кон сер-

вативности последовательностей TERT у различных организмов.

Рассмотрим известные структурные аспекты и функции доменов

TERT.

Обратно-транскриптазный доме (RT). В соответствии с при-

над лежностью к обратным транскриптазам TERT имеют в своей

струк туре 7 консервативных __________мотивов в этом домене, характерных

для обратных транскриптаз. Отличительной особенностью теломераз

явля ется большой участок вставки между мотивами А и В – IFD.

Если следовать аналогии рассмотрения полимераз в виде «правой

руки», то эти два мотива окажутся расположенными в доменах

«ладонь» и «пальцы». IFD-участок получил свое название, так как

ока зался вставкой в домене «пальцы» – I nsertion in F ingers D omain

[56]. Принадлежность TERT к обратным транскриптазам была

подтверж дена в многочисленных работах [32, 57, 58]. При этом были

найдены кон сер вативные аминокислотные остатки, ответственные

за катализ – три остатка аспарагиновой кислоты, расположенные в

моти вах А и С [58].

RT-домен в структуре TERT T. castaneum представляет собой два

субдомена («ладонь» и «пальцы»), построенных из β-листов и α-спи-

ра лей, что характерно для ретровирусных обратных транскриптаз,

вирус ных РНК-полимераз и ДНК-полимераз B-семейства. Домен поли-

мераз «большой палец» соответствует в структуре СТЕ-домену.

Теломераза: компоненты и функции, регуляторы фермента 165

Сравнение структуры TERT T. castaneum со структурой обратной

транскриптазы ВИЧ (HIV) свидетельствовало __________об их большом сход-

стве, за исключением наличия мотива IFD в TERT. Этот мотив сос тоит

из двух антипараллельных α-спиралей, играющих важную роль в

структурном расположении двух других спиралей, возможно, вовле-

чен ных в непосредственный контакт с РНК–ДНК дуплексом.

На основе сравнения структур TERT и обратной транскриптазы

вируса иммунодифицита человека (ВИЧ) и идентификации консер ва-

тив ных остатков в их структуре установлено вероятное расположение

нуклеотид-связывающего кармана. Он находится на стыке субдоме нов

«ладонь» и «пальцы».

Функционально TERT различных организмов были проанализи-

ро ваны с использованием мутагенеза. В RT-домене Est2p (TERT

дрожжей), помимо мутаций, нарушающих функцию фермента и сборку

комп лекса [47–51], обнаружены интересные мутации, вызывающие

удлинение теломер [59]. Мутации в мотиве E вызывают увеличение

процессивности в добавлении нуклеотидов [59]. Известны мутации

в субдомене «пальцы» (мотивы 1 и 2), которые приводят к тому, что

тело мераза in vivo не ингибируется хеликазой Pif1p [60]. Вообще,

известно, что активность хеликазы Pif1p приводит к удалению тело-

ме разы с теломеры. Это показано in vitro при добавлении Pif1p in

trans в реакцию удлинения праймера теломеразой [61]. При этом

про цессивность теломеразы уменьшается. Аналогичное действие

PIF1 в реакции in vitro на теломеразную активность показано и

для теломеразы человека [62]. В дрожжах in vivo в штамме pif1 Δ

тело меры оказываются длиннее, чем в штамме дикого типа. Это

удли нение зависит от теломеразы [61]. Суперэкспрессия Pif1p,

наоборот, способствует укорочению теломер [63]. Обнаружена также

такая интересная функция Pif1p, как ингибирование добавления

теломер теломеразой к двухцепочечным разрывам [64]. Мутации

в Est2p, нарушающие действие Pif1p in vivo, свидетельствуют о

взаимодействии этих белков, возможно, косвенном [60].

TEN-домен. Взаимодействие TERT с ДНК-субстратом. Еще

до кристаллизации TEN-домена TERT теломеразы Tetrahymena termophila

существовали доказательства того, что TEN-домен в TERT

дрож жей и человека представляет собой обособленный структурный

домен [49, 65]. Необходимые для функционирования теломеразы

in vitro и in vivo N-концевые домены не обнаруживают сходства с

какими-либо участками в других белках, поэтому трудно представить

возможную структуру этого участка на основе гомологии, исходя

лишь из последовательности аминокислот.

166 М. Э. Зверева и соавт.

Недавно был закристаллизован TEN-домен TERT T. termophila

[52]. Оказалось, что он представляет собой новый структурный

домен. В найденной структуре идентифицированы консервативные

а. о. и доказана их функциональная значимость. Большинство этих

остат ков группируется в бороздке на поверхности домена. Эти

остатки необходимы для каталитической активности теломеразы,

некоторые из них участвуют в специфическом взаимодействии с одно-

це почечным участком ДНК – субстратом для удлинения теломеразой.

Положительно заряженные остатки на С-конце домена вовлечены в

неспецифическое взаимодействие с РНК. Особенностями всего TEN-

домена являются взаимодействие с одноцепочечной ДНК, а также

способность связывать РНК, что необходимо для функционирования

тело меразы.

Рассмотрим подробнее, что известно о взаимодействии TERT

с ДНК-субстратом. Теломераза взаимодействует с субстратом не

только в месте отжига его 3'-конца на матричном участке TER, но и

с его 5'-концом, в так называемом «якорном сайте». Предполагается

также, что 3'-конец праймера непосредственно взаимодействует с

TERT. В теломеразах человека [66], дрожжей [67] и простейших [27]

выделяют дальний якорный сайт (~16–21 н.о. от 3'-конца праймера,

нахо дящегося в каталитическом сайте) и ближний якорный сайт,

распо ложенный ближе к 3'-концу праймера (~4–14 н.о. от 3'-конца).

Целый ряд фактов указывает на то, что якорный сайт расположен в

TEN-домене. Прежде всего, это подтверждено с помощью метода хими-

ческих сшивок [52, 68], а также с помощью мутагенеза [52, 66].

Теломераза дрожжей обладает повышенной эффективностью

удли нения коротких праймеров (~ 9 н.) и праймеров с «мутациями»

(нете ломерной последовательностью) в области ближнего якорного

сайта [67]. Это обусловлено тем, что при диссоциации от праймера

теломераза освобождается из устойчивого комплекса с ним и снова

становится активной и способной к удлинению нового праймера. При

пониженной концентрации праймера подобный эффект практически

исчезает.

Теломераза T. termophila обладает повышенной способностью

удли нять короткие праймеры [69]. По-видимому, как и теломераза

дрож жей S. cerevisiae, она легко отделяется от коротких субстратов

после удлинения, и поэтому за единицу времени способна удлинить

больше молекул праймера в условиях его многократного избытка [68].

Подобные эффекты влияния длины праймера на эффективность его

удли нения обнаружены и для теломеразы человека [66].

Теломераза: компоненты и функции, регуляторы фермента 167

Вклад ближнего и дальнего якорных сайтов во взаимодействие

процес сивных теломераз простейших и человека и непроцессивной

теломеразы дрожжей с праймером различен. Установлено, что

даль ний якорный сайт теломеразы дрожжей лишь незначительно

влияет на связывание праймера. Так, теломераза дрожжей [67],

в отличие от теломеразы человека [70], практически не удлиняет

прай меры с достаточно протяженной (8–15 н.о.) нетеломерной

после до вательностью на 3'-конце и теломерной на 5'-конце (15

н.о.). О функциональной роли и локализации дальнего якорного

сайта сведений недостаточно. Возможно, что он формируется не

за счет TERT, а за счет других компонентов комплекса. Эндогенная

и реконст руированная in vitro теломераза T. termophila по-разному

ведут себя в реакции in vitro. Оказалось, что у эндогенного фермента

процес сивность второго типа возрастает при увеличении длины

праймера, но это нехарактерно для реконструированного фермента.

Возможно, в функционировании эндогенной теломеразы T. termophila

при нимает участие дальний якорный сайт, который удерживает прай-

мер от диссоциации и стимулирует его процессивное удлинение [71].

Взаимодействие в дальнем якорном сайте (20–22 н. от 3'-конца прай-

мера) теломеразы простейших вида Euplotes aediculatus было подтверж-

дено непосредственно с помощью химических сшивок [72].

Имеются факты, свидетельствующие о том, что 3'-конец праймера

непосредственно взаимодействует с TERT. Известно, что связывание

праймера теломеразой человека зависит от положения его 3'-конца на

РНК-матрице [73]. Теломераза E. aediculatus может удлинять химер-

ные праймеры с нетеломерным 3'-концом. Химерные праймеры не

могут образовать дуплекс с РНК-матрицей. Удлинение этих прай-

ме ров начинается с начала матричного участка [74]. Возможно, это

проис ходит за счет взаимодействия 3'-конца праймера с TERT и его

пози цио нирования относительно РНК-матрицы. Теломераза дрожжей

неэффективно связывает и удлиняет праймеры, у которых два послед-

них нуклеотида на 3'-конце нетеломерные (некомплементарные

матрице) [36]. Возможно, в этом случае нарушается взаимодействие

3'-конца праймера с TERT.

Недавно, методом анализа единичных молекул с помощью флуо-

рес ценции, было непосредственно показано, что ДНК-субстрат в

отсут ствие TER образует стабильный комплекс с TERT человека [75].

Удаление TEN домена из TERT практически приводит к неактив-

ной теломеразе [52, 76]. Ряд консервативных остатков в TEN-домене

выполняют структурную роль. Большинство из них группируются с

противоположных сторон поверхности домена. С одной стороны они

168 М. Э. Зверева и соавт.

образуют глубокую канавку, другая же сторона состоит из α-спиралей,

кон сервативные остатки которых имеют в основном кислый или гид-

рофобный характер.

Для теломеразы T. termophila с помощью метода химических

сши вок обнаружено взаимодействие ДНК-праймера с TEN-доменом

[52, 55]. Это непрочное взаимодействие не фиксируется такими

мето дами, как связывание на фильтрах и изменение подвижности

под действием тока [55]. Показано, что TERT, не содержащая TEN-

до мена, взаимодействует с ДНК-праймером, причем эффективность

этого взаимодействия соответствует одной третьей от эффективности

взаимо действия полноразмерной TERT [55]. Это говорит о том, что

TEN-домен не является единственным местом связывания ДНК-прай-

мера. Аминокислотные остатки, ответственные за связывание, распо-

ло жены в структуре домена близко друг к другу. Они группируются

в окрестности бороздки на одной из сторон поверхности домена.

Полу чены интересные данные, свидетельствующие о том, что функ-

ция TEN-домена не сводится только к связыванию ДНК-прай мера.

Обнаружена мутация, которая не влияет на связывание праймера,

но влияет на активность фермента [55]. Был обнаружен контакт

ДНК-праймера с расположенным на периферии TEN-домена Trp187.

Оказалось, что этот контакт детектировался при любом из трех поло-

жений 3'-конца праймера на матрице (в начале матричного участка,

в середине и ближе к его 5'-концу). Учитывая, что праймер не может

растя гиваться при удлинении, а активный сайт фермента остается в

одном и том же месте, этот результат можно объяснить, лишь приняв,

что за счет подвижности TEN-домена изменяется положение этого

домена по отношению к активному сайту [55]. Особенно интересны

эти данные в связи с отсутствием структуры полноразмерной TERT,

включающей в себя TEN-домен. Учитывая предполагаемую длину и

геометрию РНК–ДНК дуплекса в активном сайте, можно заключить,

что расстояние между Trp187 и остатками Asp в активном центре

изменяется от 17 до 27 A в зависимости от положения 3'-конца прай-

мера на матричном участке [55]. Основываясь на данных о струк туре

этого домена, предполагают, что подвижность TEN-домена дости-

гается за счет гибкости его С-конца [52]. Благодаря такой подвиж-

ности РНК–ДНК дуплекс может перемещаться в активном центре при

удлинении праймера. Все предполагаемые варианты взаимодействия

праймера с теломеразой показаны на рис. 4.

Несмотря на то, что остаток Trp187 TERT T. termophila непосредст-

венно взаимодействует с ДНК праймером, он не является необходи-

мым для проявления каталитической активности фермента [55].

Теломераза: компоненты и функции, регуляторы фермента 169

Ухудшение взаимодействия с праймером обнаруживается при мута-

ции других аминокислотных остатков, расположенных на расстоянии

от Trp187 [55], что влияет на активность теломеразы. Предполагают,

что в связывании ДНК-праймера принимают участие целый ряд

аминокислотных остатков. Все они расположены в структуре на

поверх ности TEN-домена в районе бороздки, что подтверждается с

помощью мутагенеза и анализа структуры этого домена [52].

TEN-домен способен к неспецифическому взаимодействию с РНК

[77, 78]. Высказано предположение [52], что неспецифическое взаи-

мо действие с РНК, которое демонстрирует TEN-домен, превращается

в общей структуре фермента в специфическое.

На основе предложенных структур, гомологии, расчетов, учиты-

ваю щих электростатические взаимодействия, была построена струк-

тура TEN-домена дрожжей, в которой определено положение кон сер ва-

тивных остатков, для которых подтвержено участие в формировании

якорного сайта теломеразы дрожжей [39].

На основе структуры TEN-домена T. termophila [52] был направ-

ленно создан, а затем проанализирован ряд мутаций в TERT, предпо ло-

жительно влияющих на способность теломеразы взаимо дейст вовать с

ДНК в якорном сайте [79]. При этом удалось обнаружить, что одна из

замен (L14A), приводя к потере ферментом процессивности по второму

типу, не оказывала влияния на его взаимодействие с праймером

и добавление нуклеотидов до конца матричного участка. Замена

соседнего с L14A остатка приводила к снижению процессивности на

50%. Недавно была предложена модель, объясняющая роль якорного

сайта и конкретно найденных остатков в процессивности [79]. Суть ее

состоит в том, что процессивность обеспечивается за счет взаимо дей-

ствия TEN-домена с 5'-концом праймера и каталитическим доме ном

Рис. 4. Взаимодействия праймера с теломеразой

170 М. Э. Зверева и соавт.

во время удлинения. Это взаимодействие нарушается в тот момент,

когда происходит транслокация, а затем оно снова возникает. Пред-

по лагается, что L14A принимает участие в этом процессе.

В TEN-домене Est2p дрожжей также обнаружены мутации,

приво дящие к удлинению теломер по сравнению со штаммом дикого

типа [80]. Эти мутации не влияют на ферментативные свойства

тело меразы in vitro. Единственный участник процесса удлинения

теломеразой теломер, необходимый для того, чтобы теломеры были

длин нее – это Tel1p. Предполагают, что N-концевой домен Est2p

каким-то образом взаимодействует с Tel1p при удлинении теломер

тело меразой [80]. Среди мутаций в TEN-домене Est2p обнаружены

также такие, которые приводят к изменению ассоциации теломерного

белка Rap1p с двухцепоченой теломерной ДНК [81]. Механизм этого

влияния пока не ясен.

TRBD-домен. TERT отличается от других обратных транскриптаз

прежде всего способностью использовать внутреннюю РНК-матрицу

при добавлении теломерных повторов. В теломеразе человека TEN-

домен (RID1 по другой классификации) взаимодействует с псевдо-

уз лом TER, а TRBD-домен (RID2 по другой классификации) – со

шпиль кой Р6.1 домена CR4-CR5. Именно последнее взаимодействие

кри тично для сборки фермента [82].

Установлена структура изолированного домена TRBD T. thermophila

[53]. РНК-связывающий домен TRBD содержит в своей струк-

туре, в основном, спиральные мотивы. Эта структура уникальна.

Мотив QFP не участвует в связывании РНК, а выполняет структурную

функцию, в то время как тогда как в связывании РНК непосредственно

участвуют консервативные мотивы CP и Т. Консервативные а. о.

рас по ложены таким образом, что на поверхности образуется как

бы 2 кармана. Один из них узкий, ограниченный гидрофобными

остат ками и специфичный для связывания одноцепоченой РНК

(Т-кар ман); второй более широкий и может связывать РНК-дуплекс

(Т-СР карман) [53]. Предполагают, что в качестве двухцепочечной

РНК TRBD-домен взаимодействует со спиралью I в структуре TER T.

thermophila, а в качестве одноцепочечной – с 5'-граничным элементом

TER T. thermophila.

Детальная картина положения аминокислотных остатков объяс-

няет эффекты описанных мутаций в TRBD домене TERT [53]. Оба

РНК-связывающих кармана охватывают по периментру всю поверх-

ность домена.

Известно, что кроме TRBD-домена, в связывании TER, а именно

5'-граничного элемента, участвует мотив CP2, на границе доменов

Теломераза: компоненты и функции, регуляторы фермента 171

TEN и TRBD [83, 84]. Каким образом регулируется связывание

TRBD-домена и мотива CP2, а также функциональная значимость

взаи модействия 5'-граничного элемента с мотивом CP2 не ясно.

На основе структуры TRBD-домена T. thermophila трудно делать

выводы о том, как в теломеразах дрожжей и человека реализуются

взаимо действия, необходимые для сборки и активности фермента.

Дело в том, что элементы РНК, взаимодействующие с TERT, отли ча-

ются у разных организмов, хотя различные TERT проявляют между

собой гомологию. Мы вернемся к этой проблеме в разделе, посвя щен-

ном TER.

Среди белков, взаимодействующих с компонентами теломераз-

ного комплекса, обнаружен интересный ядрышковый белок PinX1p,

который конкурирует с TLC1 РНК (TER дрожжей S. cerevisiae) за

взаимо действие с Est2p (TERT дрожжей S. cerevisiae) [85]. Гомолог

PinX1р дрожжей обнаружен и у человека – это белок PinX1 [86,

87]. Этот белок является отрицательным регулятором теломеразы и

взаимо действует с hTERT. Возможно, TERT взаимодействует с PinX1

с помощью того же домена, что и с TER, то есть домена TRBD. Роль

взаимо действия TERT c PinX1 до сих пор не ясна. Предполагают, что

таким образом TERT, несвязаная с TER, «хранится» в неактивном

сос тоянии [85].

CTE-домен. В структуре TERT T. castaneum CTE-домен по отно-

шению к остальным доменам расположен определенным обра зом и

представляет собой так называемый «большой палец», если следовать

общепринятой классификации доменов полимераз. Струк тура

этого домена не похожа на структуры соответствующих доменов

обратных транскриптаз. Показано, что CTE-домен TERT представ-

ляет собой новый структурный домен [54]. В структуре CTE-домен

простанственно сближен с TRBD-доменом. Такая организация

доменов TERT приводит к образованию цетрального «отверстия»,

доста точного по ширине для аккомодации двухцепочечных нуклеи но-

вых кислот длиной 7–8 оснований, что хорошо соглаcуется с экспери-

ментальными данными о длине дуплекса в активном центре теломе-

разы [88]. Джиллис и соавт. смоделировали положение РНК–ДНК

дуп леска в полученной структуре TERT. Согласно этой модели одна из

спи ралей CTE-домена взаимодействует с малой бороздкой РНК–ДНК

дуп лекса. Справедливость полученной модели подтверждают экспери-

ментальные факты, полученные ранее на основе мутагенеза [89, 90].

Ранее предполагалось, что CTE-домен не важен для функциони ро-

вания теломеразы дрожжей in vivo [51]. Однако более поздние све де-

ния говорят о важности этого домена для стабильности белка Est2p

172 М. Э. Зверева и соавт.

и эффективности удлинения ДНК-субстрата [59, 89]. В теломе разе

человека мутации в СТЕ-домене приводят к нарушению функцио ни-

рования теломеразы, сходному с некоторыми мутациями в TEN-до-

мене [91, 92].

Нуклеазная активность теломеразы. Теломеразы проявляют

нуклеазную активность по отношению к олигонуклеотидным субст-

ра там. Эндонуклеазная активность выявлена в теломеразной фракции

дрожжей, подвергнутой многостадийной очистке с использованием

различных видов аффинной хроматографии [41]. Нуклеазной актив-

ностью обладают также реконструированные in vitro теломеразы

чело века [43, 44] и простейших [93]. Нуклеазная активность теломе-

разы дрожжей зависит от концентрации нуклеотидов [41]. Однако

отвечающий за нуклеазную активность домен теломеразы не иден-

ти фицирован.

Теломераза с наибольшей вероятностью вносит разрыв на гра-

нице спаренных и неспаренных оснований праймера и матричного

участка TER [41, 43]. Теломераза человека даже полностью может

расщеп лять теломерный олигонуклеотид в зависимости от его поло-

же ния на матрице при отжиге [43]. Следует отметить, что если в

пред почтительные места разрезания ввести негидролизуемые меж нук-

леотидные связи, то фермент способен расщеплять ДНК-субстрат в

других местах [41, 44]. Химерные праймеры могут быть разрушенны

и относительно далеко от 3'-конца – на границе теломерной и нетело-

мерной областей [41, 44]. Оставшиеся теломерные концы затем

удли няются ферментом. Как уже упоминалось выше, теломераза

дрож жей в отличие от теломеразы человека не способна удлинять

прай меры с достаточно протяженной 3'-концевой нетеломерной

после довательностью. Такие праймеры служат плохими субстратами

и для нуклеазной активности. Возможно, в теломеразе человека во

взаимо действие с подобными праймерами вовлечен дальний якорный

сайт [44].

Трансферазная активность. Было показано, что в присутствие

Mn 2+ теломераза дрожжей и человека может работать как терминальная

трансфераза, то есть, способна присоединять нуклеотиды независимо

от матрицы [94]. Даже в таком необычном качестве теломераза отдает

предпочтение GT-богатым, теломер-подобным с 5'-конца субст-

ратам. Явление терминально-трансферазной активности объяс няет

ряд физиологических процессов. Известно, например, что супер-

экспрессия теломеразной обратной транскриптазы млеко пи тающих

провоцирует преждевременное старение клеток и появление рака,

что не может быть объяснено влиянием белка на длину тело мер.

Одним из возможных объяснений этого явления может слу жить

Теломераза: компоненты и функции, регуляторы фермента 173

пред положение о том, что суперэкспрессия TERT выявляет обычно

скры тую терминально-трансферазную активность белка и, как

следст вие, оказывает губительное воздействие на физиологию

клетки. Неизвестно, является ли внутриклеточная концентрация Mn 2+

достаточной для такого преобразования теломеразы в нормальных

или патологических условиях. С другой стороны, возможно, что еще

не идентифицированы небольшие молекулы, которые могли бы при-

во дить к такому же результату [94].

Защитные функции теломеразы. В ряде работ было обнаружено

интересное явление. Мутанты компонентов корового фермента тело ме-

разы дрожжей и человека влияли на рост клеток, их фенотип, неза ви-

симо от эффекта на длину теломер [38, 95]. Нобелевский лауреат 2009

года Элизабет Блэкберн предложила следующее объяснение наблю-

даемым явлениям: теломераза, помимо удлинения концов теломер,

прояв ляет защитные функции на теломере [96]. К настоящему вре-

мени появилось уже довольно много работ, свидетельствующих

о том, что не столько укорочение теломер приводит к сенессенсу,

сколько нарушение их структуры, а, следовательно, защитной функ-

ции. Нарушение структуры теломер сопровождается появлением

<