Методы специфической диагностики

Для лабораторной диагностики ЦМВИ используют прямые и косвенные методы.

Прямые методы предназначены для выявления ЦМВ (вирусологический метод) или его специфических антигенов (иммунологический метод) и нуклеиновых кислот (молекулярно- биологический метод).

Косвенные методы предназначены для выявления иммунного ответа организма на ин- фекцию (серологический метод) или выявления характерных изменений клеток и тканей под воздействием ЦМВ (цитологический и гистологический метод). В рутинной лабораторной диагностике ЦМВИ используют серологические (ИФА, иммунохемилюминисценция) и мо- лекулярно-биологические методы (ПЦР). ИФА используют для выявления в крови антител классов G и M к антигенам ЦМВ, а также для определения индекса авидности IgG антител. Результаты ИФА предназначены для определения формы ЦМВИ - острой, латентной, актив- ной (вследствие реактивации). При острой инфекции выявляют IgM антитела и/или низко- авидные IgG антитела. При первичном заражении вирусом на 5–7 день вырабатываются ан- ти-ЦМВ IgM, через 10–14 дней – низкоавидные анти-IgG, затем постепенно авидность анти- тел увеличивается, они становятся высокоавидными. Анти-IgM в большинстве случаев исче- зают через 1-2 месяца, низкоавидные анти-IgG – через 1–3 месяца, высокоавидные антитела класса IgG циркулируют в крови носителя пожизненно. При использовании различных тест- систем для выявления анти-ЦМВ IgM антител с целью диагностики острой ЦМВИ специ- фичность и чувствительность тестов составляют 56-75% и 30-88%, соответственно. Чувстви- тельность низкого индекса авидности антител у матери как фактора риска заражения плода составляет 100% при исследовании крови на сроке беременности 6–18 недель и 63% при проведении анализа на 20-23 неделе беременности (сочетание с выявлением анти-ЦМВ IgМ увеличивает этот показатель до 80%). Если низкая авидность выявлена на сроке 12-16 не- дель, то нельзя полностью исключить недавнее инфицирование до момента зачатия.

При латентной инфекции в крови присутствуют только высокоавидные IgG антитела. При активной ЦМВИ вследствие реактивации или реинфекции вируса возможно выявление IgM антител (в меньшем титре и на протяжении более короткого временного периода по- сравнению с острой ЦМВИ) и высокоавидные IgG антитела. Титр или количество IgG анти- тел не отражает степени репликативной активности ЦМВ и не может служить основанием для постановки диагноза активной ЦМВИ и назначения специфической противовирусной те- рапии.

Иммуноблот, позволяющий детектировать анти-IgМ и анти- IgG к отдельным структур- ным и неструктурным белкам ЦМВ, является золотым стандартом для выявления антител класса IgМ (аналитические чувствительность и специфичность 100%). Иммуноблот позволя- ет подтвердить специфичность исследования, следить в динамике за появлением и исчезно- вением отдельных белков, что имеет диагностическое и прогностическое значение. Наличие антител к высокоспецифичным антигенам подтверждает формирование иммунного ответа к

ЦМВ. Присутствие антител к антигену рр65 (ранний белок), рр72 (предранний белок) расце- нивается как маркер активной репликации вируса. По мере развития инфекционного процес- са появляются антитела к белку рp28. Метод иммуноблота является дорогим и редко исполь- зуется в практическом здравоохранении.

Метод иммунохемилюминисценции обладает существенно более высокими аналитиче- скими чувствительностью и специфичностью по сравнению со стандартным меодом ИФА, что кардинально снижает верояность ложноположиельных резульаов.

Решающее значение для установления наличия активного инфекционного процесса (ак- тивной репликации вируса) и подтверждения ЦМВ-природы поражения органов принадле- жит прямым методам выявления вируса, его антигенам и ДНК. Вирусологический метод, ос- нованный на выделении ЦМВ из биологических жидкостей на культуре клеток является спе- цифическим, но трудоемким, длительным, дорогим, малочувствительным методом, не по- зволяющим определять количественное содержание возбудителя в биологических жидко- стях. В практическом здравоохранении не используется.

Предложен “быстрый культуральный метод” с предварительным внесением биоматериа- ла в культуру фибробластов и выявлением вирусных антигенов - “ранних белков” путем анализа инфицированных ими клеток культуры. Для обнаружения предраннего и раннего белков вируса с молекулярной массой рр72 и рр65 в слюне и моче используют метод РИФ. По количеству светящихся клеток делают вывод об интенсивности выделения вируса. Время выполнения исследования 24–36 часов. В диагностике активной ЦМВИ используют опреде- ление в лейкоцитах крови вирусного антигена pp65 иммуноцитохимическим методом. Появ- ление в крови вирусного белка pp65 опережает развитие клинических симптомов ЦМВИ, ко- личественный уровень антигенемии коррелирует с развитием клинических симптомов ЦМВИ и вероятностью ЦМВ-болезни. Современная методика детекции активной ЦМВИ пу- тем определения ЦМВ-антигена pp67 методом mRNA NASBA показывает большую специ- фичность по сравнению с pp65-антигенемией и позволяет определять антиген ЦМВ в замо- роженных или лизированных образцах крови. Методы выявления антигенов уступают по чувствительности молекулярным методам, основанным на полимеразной цепной реакции (ПЦР), дающим возможность прямого качественного и количественного обнаружения ДНК ЦМВ в биологическом материале в кратчайшие сроки.

ПЦР используют для выявления и определения концентрации ДНК ЦМВ в различных биологических жидкостях (кровь, СМЖ, БАЛЖ, моча, слюна, цервикальный секрет) и тканях (биоптаты, операционный материал, аутоптаты). Методики, основанные на ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) позволяют определять концентрацию ДНК ЦМВ в биологиче- ских жидкостях или тканях (клетках). Результаты исследований могут быть выражены в ко- пиях или международных единицах (МЕ) ДНК ЦМВ на миллилитр биологической жидкости (цельной крови, плазмы крови, СМЖ, АЖ), или в копиях, десятичных логарифмах копий ДНК ЦМВ на стандартное количество клеток (лейкоцитов крови). Результаты количествен- ной ПЦР предназначены для определения степени репликативной активности ЦМВ и обос- нования наличия манифестной инфекции - ЦМВ-природы поражения органа (выявление ДНК ЦМВ в клетках или плазме крови, СМЖ, БАЛЖ в клинически значимой концентра- ции).

Наличие ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови беременной является достоверным признаком активной репликации ЦМВ и служит важным маркером высокого риска антенатального за- ражения вирусом плода. При первичном инфицировании в стадии “серологического окна” до

начала синтеза антител выявление ДНК ЦМВ в крови является единственным маркером ак- тивной репликации вируса. Положительное прогностическое значение обнаружения ДНК ЦМВ в клетках крови (вероятность заражения плода) составляет 50-60%. Отрицательное прогностическое значение точно не установлено. ДНК ЦМВ в крови выявляется лишь у 50% беременных с острой ЦМВИ. Частота выявления ДНК ЦМВ составляет 80–100% в первый месяц развития острой ЦМВИ, но существенно снижается через 30 дней от момента ее выяв- ления.

Присутствие ДНК ЦМВ в слюне беременной является лишь маркером инфицированно- сти и не свидетельствует о существенной вирусной активности. Наличие ДНК ЦМВ в моче доказывает факт заражения и определенную вирусную активность, но вследствие длительно- го обнаружение вируса в моче данный маркер не может быть единственным лабораторным критерием активной ЦМВИ и требует дополнительных исследований. Прогностическая цен- ность изолированного обнаружения вируса в моче беременной для антенатальной ЦМВИ со- ставляет не более 20-30%. Вероятность антенатального заражения плода возрастает при со- четании наличия ДНК ЦМВ в моче и анти-ЦМВ IgМ в крови.

Прямым доказательством заражения плода является обнаружение ДНК ЦМВ в амниоти- ческой жидкости и пуповинной крови. При выявлении у беременной лабораторных маркеров острой ЦМВИ (антител класса IgM, низкоавидных IgG антител, ДНК ЦМВ в крови или мо- че), рекомендовано проведение амниоцентеза и исследование амниотической жидкости через 5–7 недель после постанови диагноза острой ЦМВИ у матери но не ранее 16-й недели геста- ции. Данные сроки обусловены необходимым временным интервалом между инфицировани- ем ЦМВ плода, репликацией вируса в почках и его выделением с фетальной мочой с обна- ружением в амниотической жидкости. Положительное прогностическое значение (вероят- ность выявления факта заражения плода) составляет 90-100%, отрицательная прогностиче- ская ценность (специфичность) – 92-98%. Отсутствие ДНК ЦМВ в амниотической жидкости означает, что плод не инфицирован. Риск заражения ЦМВ и развития клинически выражен- ной врожденной ЦМВИ у ребенка связан с концентрацией ДНК ЦМВ в амниотической жид- кости. При количестве ДНК ЦМВ <10³ копий/мл в 83% случаях ребенок останется не инфи- цированным, при количестве ДНК ЦМВ 10³ копий/мл и более в 100% случаях ребенок зара- жен. Уровень ДНК ЦМВ <10⁵ копий/мл с вероятностью 92% свидетельствует об отсутствии манифестации инфекции у плода и новорожденного. Концентрация ДНК ЦМВ в амниотиче- ской жидкости 10⁵ копий/мл и более означает развитие у ребенка клинически выраженной ЦМВ-болезни. Кордоцентез и исследование пуповиной крови на наличие ДНК ЦМВ и спе- цифических IgM антител проводят с 20-й недели беременности. Специфичность выявления ДНК ЦМВ и IgM антител приближаются к 100%, чувствительность находится в пределах 41– 85%. Чувствительность выявления IgM антител значительно уступает чувствительности вы- явлению ДНК ЦМВ.

Для подтверждения цитомегаловирусной природы поражения органов целесообразно проведение инструментальных методов исследования (диагностической фибробронхоско- пии, плевральной пункции, люмбальной пункции, ЭГДС) и исследование полученных биоло- гических материалов (БАЛЖ, плевральной жидкости, биопттов бронхов, СМЖ, биоптатов ЖКТ) на наличие ДНК ЦМВ.

Подтверждением ЦМВ-природы имеющихся у больного клинических проявлений забо- левания и патологических изменений в органах является обнаружение при гистологических исследованиях биопсийных или аутопсийных материалов специфических цитомегалоклеток.

Чувствительность стандартного гистологического метода диагностики ЦМВ-заболевания не превышает 50%. Для повышения чувствительности и специфичности метода дополнительно исследуют гистологические препараты для выявления в тканях вирусного антигена или ДНК ЦМВ.

Метод	Показания	Сила*

Серологические методы

Выявление специфических антител класса IgG Женщины, планирующие беременность, или женщи- ны на раннем сроке беременности, для выявления серонегативных женщин, которые составляют груп- пу риска острой ЦМВИ во время беременности A Выявление специфических антител класса IgM Пациенты, в том числе беременные, прежде всего с клиническими симптомами инфекционного моно- нуклеоза, ОРВИ или подозрением на острую ЦМВИ для определения нозологии С Определение индекса авид- ности IgG антител Беременные с клиническими симптомами инфекци- онного мононуклеоза или подозрением на острую ЦМВИ, у которых при наличии IgG антител опреде- ляются антитела классов IgM, для дифференциации острой ЦМВИ от реактивации вируса. A