Методы анализа полисахаридов

Общий принцип выяснения последовательности моносахаридных остатков в полисахариде состоит в расщеплении цепи на олигосахаридные фрагменты, установлении строения таких фрагментов и последующей реконструкции структуры макромолекулы по структурам олигосахаридов.

Выяснение конфигурации гликозидных связей - и есть задача моно-мерного анализа, она относится к детализации структуры отдельных звеньев. Проблема в том, что все методы мономерного анализа очень деструктивны и обязательно включают расщепление гликозидных связей. А при всех известных способах расщепления гликозидных связей, применяемых в мономерном анализе полисахаридов (кроме ферментативного гидролиза, см. ниже), информация о конфигурации этой связи теряется.

Похоже, универсальный (гипотетический) метод определения конфигурации гликозидных связей в полисахаридах реализует себя вот так. Это должен быть такой метод расщепления гликозидных связей, который приводил бы количественно к производным моносахаридов, подобно кислотному гидролизу. Но с той, однако, разницей, что структура этих производных должна зависеть от конфигурации расщепляемой гликозидной связи исходного остатка. Тогда мы имели бы метод мономерного анализа, который одновременно давал бы информацию и о природе каждого мономерного звена, и о конфигурации его гликозидной связи. Наилучшее доступное сейчас приближение к идеалу - это окисление ацетатов полисахаридов хромовым ангидридов в уксусной кислоте.

Современные методы определения структуры полисахаридных цепей несовершенны и имеют ограниченную область. Нельзя, однако, забывать о резком расширении возможностей наших методов при их совместном применении. Например, частичный кислотный или ферментативный гидролиз удаляет боковые цепи. Для этого разбирают продукты гидролиза на моносахаридный состав и длину боковых цепей, а также главную цепь, которая анализировать значительно легче. Для этого полисахарид подвергают деградации по Смиту, которая в благоприятном случае приводит к расщеплению главной цепи. Мы получаем, так сказать, две неполные карты структуры в разных красках. А их наложение друг на друга даст уже полную картину. Вот так для большинства полисахаридов удается уже сейчас собрать почти исчерпывающую структурную информацию [8].

Деградация по Смиту:

Деградация по Смиту основана на более избирательной, но и более сложной последовательности реакций. Ключевой стадией здесь служит окисление полисахарида солями иодной кислоты - периодатами. При этой реакции происходит разрыв С-С-связи в гликолях с образованием диальдегида, последующее восстановление которого приводит к образованию диола.

Гликозидные связи, соединяющие моносахаридные звенья друг с другом, чувствительны к действию кислот, поэтому обработка полисахаридов кислотами вызывает их деполимеризацию. Основной функциональной группировкой полисахаридов является гидроксильная группа, и превращения этой группы - в первую очередь, получение простых и сложных эфиров и окисление - играют очень большую роль и при установлении строения, и в практическом использовании полисахаридов. Интересно отметить, насколько резко отличаются простые и сложные эфиры полисахаридов от свободных полисахаридов по физическим свойствам. Эти эфиры плохо растворимы в воде, легко растворяются в органических растворителях, причем в производных такого типа отсутствует сильное межмолекулярное взаимодействие, так как нет возможностей для образования водородных связей. Другие функциональные группы, встречающиеся в полисахаридах, также могут участвовать в обычных превращениях. Так, карбоксильные группы уроновых кислот могут быть этерифицированы, восстановлены, аминогруппы аминосахаров - ацилированы и т.д. Общими особенностями реакций полисахаридов, связанными с их полимерным характером, являются трудность достижения полноты реакции по всем функциональным группам макромолекулы, и трудность проведения избирательных реакций, если только реагирующие группы не отличаются очень сильно по реакционной способности.

Полисахарозам соответствует общая формула (С6Н10О5) n * Н20, где п - достаточно велико; они безвкусны, аморфны и не растворимы в воде. Так же, как и дисахарозы, они при гидролизе превращаются в С6- и С5 - сахара [3].

Подлинность моносахаридов

Подлинность глюкозы и лактозы устанавливают, нагревая до кипения растворы препаратов с реактивом Фелинга. При этом глюкоза образует кирпично-красный осадок оксида меди (I). При действии на глюкозу, сахаро-зу и лактозу аммиачным раствором нитрата серебра выделяется черный оса-док серебра.

Для испытания подлинности к раствору сахарозы (1:2) последовательно прибавляют растворы нитрата кобальта и гидроксида натрия. Появляется фиолетовое окрашивание [11].

Pастворы глюкозы и лактозы образуют с фенилгидразином выпадающие в осадок фенилгидразоны. При последующем нагревании на водяной бане получаются окрашенные в желтый цвет озазоны. Озазоны имеют характерную температуру плавления. Глюкоза взаимодействует с тремя молекулами фенилгидразина:

Под воздействием минеральных кислот или щавелевой кислоты моно- и дисахариды превращаются при нагревании в пробирке на пламени горелки в фурфурол или его производные (дисахариды вначале гидролизуются в моносахариды). Из гексоз (глюкоза) образуется окси мети л фурфурол, а из пентоз (фруктоза) - фурфурол:

Фурфурол или оксиметилфурфурол, являясь летучими соединениями, взаимодействуют с анилином или новокаином, нанесенным на фильтровальную бумагу, которой накрывают пробирку. Вначале образуются основания Шиффа, имеющие светло-желтую окраску, а затем фурановый цикл раскры-вается и получается йолиметиновый краситель - производное оксиглюта-конового альдегида (малиново-фиолетовое окрашивание):

Углеводы образуют со спиртовым раствором б-нафтола и концентрированной серной кислотой cоединения хиноидной структуры, окрашенные в красно-фиолетовый цвет. В основе реакции также лежит процесс образования фурфурола или оксиметилфурфурола, которые конденсируются с б-нафтолом в триарилметановое хиноидное соединение [4].

Качественные реакции на полисахариды:

Pеакция на крахмал с раствором йода:

При нанесении на порошок 2-3 капли раствора йода наблюдается сине-фиолетовое окрашивание.

Реакция на целлюлозу с раствором йода:

На порошок наносят пипеткой каплю раствора йода. Целлюлоза окрашивается раствором йода в желтый или коричневый цвет.

Pеакция на слизи со щелочью:

При смачивании порошка раствором едкого натра появляется желтое окрашивание.

Реакция на слизи с тушью:

Семена льна измельчают и помещают на предметное стекло в каплю туши (разведенную водой 1:10), тщательно перемешивают и накрывают покровным стеклом. На темно-сером (почти черном) фоне выделяются белыми пятнами клетки со слизью.

Реакции на инулин:

- проводят реакцию с раствором йода для доказательства отсутствия крахмала;

- на образец наносят пипеткой 2-3 капли 20% спиртового раствора б-нафтола и каплю концентрированной серной кислоты. С течением времени появляется фиолетовая окраска.

Осаждение слизи этанолом из водного извлечения:

10 г. измельченного сырья (листья подорожника) помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл воды и нагревают с обратным холодильником на электрической плитке в течение 30 минут, поддерживая слабое кипение. Извлечение фильтруют через 5 слоев марли.

К 10 мл фильтрата прибавляют 10-30 мл 95% этанола и перемешивают.

Появляются хлопьевидные сгустки, выпадающие в осадок при стоянии (полисахариды).

Реакция с ацетатом свинца:

К 2 мл извлечения из подорожника прибавляют 2 мл раствора ацетат свинца. Выпадает объемный осадок слизи.

Реакция с раствором щелочи (аммиака):

К 1-2 мл 10% настоя корня алтея, приготовленного на холодной воде, прибавляют несколько капель раствора гидроксида натрия (или аммиака).

Смесь приобретает лимонно-желтую окраску.

Реакция с хлористоводородной кислотой:

В пробирку наливают 1 мл 10% настоя корня алтея и прибавляют несколько капель концентрированной хлористоводородной кислоты. Образуется желтовато-зеленое окрашивание. К смеси приливают 2 мл 95% этанола. Слизь коагулирует в пористый сгусток [5].

Xимические методы

Для определения содержания моносахаридов (МС), установления моносахаридного состава в образцах полисахаридов, определения местоположения заместителей и вида гликозидных связей используют разнообразные химические методы в сочетании с методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ). Для анализа полисахаридов методом ГЖХ их подвергают гидролизу до МС с последующим получением летучих производных. Как правило, для гидролиза используют серную и трифторуксусную (ТФУ) кислоты, но предпочтение отдают более летучей и легко удаляемой ТФУ. Преимуществом данного метода является его высокая чувствительность и использование небольшого количества вещества. [8].

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные в последние годы исследования по изучению различных свойств полисахаридов растений показывают, что перспектива полиуглеводов в создании новых лекарственных средств лежит в их будущем использовании при комплексном лечении. Многофункциональность ранее казавших фармакологических индифферентых углеводных соединении лежит в областях профилактики (например, простудных заболеваний), лечении (при различных кровотечениях) и диагностики разных болезней (рентгеновская или компьютерная томография).

В независимости от появления новых фармацевтических технологии по созданию новых лекарственных средств, фармацевтический анализ углеводных биополимеров сложен и требует комбинирования различных методик.

Проведено исследование влияния полисахаридных комплексов из сырья 10 видов высших растений на развитие экспериментальной опухоли и её цитостатическое лечение. Впервые выявлено, что:

- полисахаридные комплексы из цветков липы сердцевидной, побегов багульника болотного, корневищ аира болотного и листьев мать-и-мачехи повышают противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана в отношении карциномы легких Льюис у мышей;

- полисахариды аира оказывают самостоятельное противоопухолевое действие, а полисахариды липы, багульника и солодки проявляют самостоятельный антиметастатический эффект;

- полисахариды левзеи, одуванчика и подорожника потенцируют противоопухолевую и не влияют на антиметастатическую активность циклофосфана [3].