Использование биотехнологических приемов при производстве биологически активных веществ. Первичные и вторичные метаболиты

Вопрос 1. Производство первичных метаболитов. Технология получения лизина и кормовых препаратов на его основе. Биосинтез первичных метаболитов.

Вопрос 2. Технология биосинтеза препаратов антибиотиков (тетрациклина) и бактериальных препаратов для сельского хозяйства. Вторичные метаболиты.

Первичные метаболиты - это низкомолекулярные соединения, необходимые для роста микробов. Наиболее важными для промышленности являются аминокислоты, органические кислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, растворители и витамины. Микробные клетки, как и клетки других живых существ, не производят избытка первичных метаболитов, что было бы расточительно и уменьшало способность к выживанию. Но существуют и микробные штаммы с нарушениями регуляции синтеза этих метаболитов, которые и служат исходными штаммами для промышленных процессов. Многие аминокислоты и нуклеотиды производятся в процессе ферментаций, осуществляемых ауксотрофами (т.е. микробами, нуждающимися для воспроизведения в факторах роста), у которых нарушены процессы регуляции синтеза ферментов. Штаммы Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum превращают более трети сахаров, содержащихся в культуральной среде, в лизин. Получается не менее 75 г лизина на 1 л среды. Лизин - конечный продукт разветвленного метаболического пути, который также ведет к синтезу метионина и треонина (незаменимые аминокислоты, которые способствую расщеплению жиров, не вырабатываются в животном организме, необходимо поступление извне). Аминокислоты. Из 20 аминокислот, составляющих белки, восемь не могут синтезироваться в организме человека. Эти незаменимые аминокислоты должны содержаться в пище. Особенно важны метионин и лизин. Метионин производится синтетически, тогда как 80 % лизина - биосинтетически. Микробиологическим синтезом можно получить биологически актиивные изомеры (L -аминокислот), в то время как при химическом синтезе получаются равные количества обоих изомеров. Поскольку их трудно разделить, половина продукции оказывается биологически бесполезной.

Глутаминовая кислота, которая в виде натриевой соли применяется в качестве специи, синтезируется исключительно культурами Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum. Субстратом для этих видов ферментации служит глюкоза. Но в конце 1960-х гг. использовали n -парафины из-за их избытка и дешевизны. Еще одним потенциальным субстратом, не столь дорогим, как глюкоза, является уксусная кислота. Основным субстратом для производства лизина и глутаминовой кислоты служит патока (меласса) - отход производства сахара.

Corynebacterium glutamicum растет в среде c меньшей, чем оптимальная, концентрацией биотина, нарушается синтез мембранных фосфолипидов, в результате глутамат натрия проходит через мембрану и накапливается в среде. То же происходит при добавлении к культуральной среде пенициллина: этот антибиотик подавляет синтез клеточной стенки и тем самым способствует выделению аминокислот.

Промышленное производство аминокислот, особенно лизина и метионина, будет развиваться не только для питания людей, но и для получения добавок в комбикорм скота. Растет также спрос на глицин, аланин и цистеин: первые две аминокислоты используются как приправы, третья - для создания пористой структуры хлеба. Аминокислоты используются также для лечения заболеваний желудка и печени, чем также объясняется повышенный спрос на них.

Органические кислоты. Важнейшей промышленной органической кислотой является уксусная кислота. Она используется при производстве резины, пластмасс, ацетатных волокон, фармацевтических препаратов, инсектицидов и т.д. В Японии уксусная кислота применяется как субстрат при ферментации для производства аминокислот. Окисление этанола в уксусную кислоту посредством уксуснокислых бактерий экономически выгодно при получении уксуса. Общепринятый химический синтез основан на карбонилировании метанола. Термофильные бактерии Clostridium aceticum и Acetobacter woodi способны превращать в уксусную кислоту углекислый газ и водород.

Лимонную кислоту получают из мелассы при помощи Aspergillus niger. Ферментативное производство может стать экономически более выгодным, если в качестве субстрата использовать целлюлозу. Целлюлоза разлагается под действием штаммов A. niger, в которые будут перенесены гены целлюлаз.

Молочная кислота - первая из органических кислот, которую начали производить путем брожения. Она находит широкое применение в качестве окислителя в пищевой промышленности, как протрава в текстильной промышленности, в гальваностегии и производстве пластмасс. Половину общего количества молочной кислоты получают при сбраживании глюкозы Lactobacillus delbrueckii.

Ключевым фактором при нескольких видах брожения является нехватка определенных металлов. Производство лимонной кислоты при помощи Aspergillus niger происходит при нехватке железа и марганца. Для продуцирования фумаровой кислоты Rhizopus negricans нужна нехватка цинка.

Витамины. Воздействуя на регуляцию метаболизма, и прибегая к генетическим манипуляциям, можно значительно повысить производство отдельных витаминов: например, Ashbyia gossypii производит рибофлавина в 20 000 раз больше, чем необходимо для роста, а Pseudomonas denitrificans способен производить в 50000 раз больше, чем необходимо, витамина B_12.  В СНГ рибофлавин (витамин В₂) и витамин B₁₂ получают микробиологическим путем для балансировки комбикормов.

Пиво варят из ячменного солода (реже используют просо или сорго). Соложение индуцирует в семенах ферменты, которые либо в процессе соложения, либо позднее катализируют гидролиз крахмала. В дальнейшем ячменный солод размельчают и смешивают с водой при температуре не выше 67^о С. В течение нескольких часов цепи крахмала разрываются, и происходит частичный протеолиз. Водный экстракт, называемый солодовым суслом, кипятят вместе с хмелем. В процессе кипячения прекращается ферментативная активность, осаждаются белки из сусла и экстрагируются вкусовые компоненты хмеля. Затем в сусло засеваают штамм Sacharomyces cerevisiea, который сбраживает сахара в спирт и углекислый газ (в процессе брожения дрожжевая биомасса увеличивается в пять раз). Ряд других соединений, придающих пиву его особенный вкус, образуются в незначительных количествах. Среди них амиловый, изоамиловый и фенилэтиловый спирты, концентрация которых составляет около нескольких миллиграммов на 1 л, уксусная и маслянаяя кислоты, а также эфиры. После окончания брожения дрожжи отделяют от пива, которое после необходимого периода созревания фильтруют и пастеризуют. Большинство видов легкого пива получают при помощи дрожжей, которые оседают на дно ферментера. Такие дрожжи низового брожения были в 1880 г. выведены в чистую культуру датским ботаником Хансеном, работавшим в Карлсбергском институте в Копенгагене (отсюда название Saccharomyces carlsbergensis). Дрожжи верхового брожения, не оседающие в процессе ферментации, являются штаммами S. cerevisiae и используются для получения разновидностей пива с повышенной концентрацией спирта.

Виноделие. Модернизация процесса спиртового брожения заключается в отборе более эффективных штаммов S. cerevisiae, которые добавляют к виноградному соку, в регулировании температуры брожения в диапазоне 7-14 ⁰С, а также в попытках достигнуть непрерывного брожения для получения ординарных вин.

Спирт. В отличие от пивоварения для производства спиртов из зерна не нужно кипятить сусло, поэтому, хотя брожение продолжается дольше, зато спирта производится больше. Характер последующей перегонки зависит от вида алкогольных напитков. Для многих алкогольных напитков ферментируемая жидкость помещается в перегонные кубы вместе с дрожжами; последние наряду с компонентами, экстрагированными из деревянных бочонков, в которых выдерживаются спиртные напитки, придают вкус конечному продукту.

Одним из лимитирующих факторов в ферментационном производстве этанола является неспособность микроорганизмов переносить высокие концентрации спирта. Остановка процесса брожения происходит при достижении относительно высокого уровня концентрации спирта.

Производство синтетического каучака. N-бутанол (n означает «нормальный», т.е. молекула представляет собой прямую цепь атомов углерода и не разветвлена) используется для производства пластификаторов, гидравлических тормозов, карбамидной смоолы, экстрагирующих веществ и добавок к бензину. Он производится почти исключительно химическим путем. Однако еще в 1912 г. Вейцманн, работавший тогда в Манчестерском университете, обнаружил, что Clostridium acetobutilicum и C. saccharoacetobutilicum сбраживают крахмал и сахарозу соответственно в n-бутанол и ацетон. Вейцманн для получения синтетического каучука синтезирован бутадиен из n-бутанола. В ЮАР n-бутанол производится из мелассы, в других странах обычно их нефтепродуктов. Лимитирующим фактором при ацетонобутаноловом брожении является токсичность n-бутанола для бактерий. Первые промышленные штаммы C. acetibutilicum сбраживали от силы 3,8 % крахмала. При этом выход спирта составлял 1,2 %. В лабораторных условиях удалось достигнуть устойчивости бактерий к 2,85 % спирта при условии добавления в культуральную среду активированного древесного угля.

Производство спирта - развитая отрасль промышленности, продолжающаяся развиваться. Ряд задач спиртовой промышленности можно решить путем усовершенствования процессов солодоращения с применением стимуляторов роста, осахаривания с использованием вакуумного осахаривания, производства ферментных препаратов, организации упрощенной технологии их получения с применением более дешевого сырья и более интенсивных методов их выращивания, а также получение концентрированных сухих ферментов с использованием мембранной технологии с ультрафильтрацией.

Процесс получения спирта из крахмалосодержащего сы рья включает следующие стадии: 1) разваривание и осахаривание разваренной массы ферментными препаратами или солодами; 2) сбраживание осахаренного затора.

На этих этапах ферменты имеют очень большое значение. Применение амилолитических ферментов дает ускорение и углубление осахаривания крахмала, а применение целлюлолитических ферментов позволяет получить из целлюлозы сахара, тем самым увеличивая количество сбраживаемых сахаров.

Новые тенденции в производстве этанола.  Перед проведением ферментации сырье (сахарный тростник, маниок, сахарная свекла, кукуруза, пшеница. Картофель) должно пройти подготовку, в результате которой получают чистый, прозрачный стерильный сахаросодержащий раствор. Далее процесс ферментации осуществляется непрерывно в ферментерах большого объема до 1000 м³). К новым способам и приемам по сравнению с классическим получением пива и вина относятся: использование новых штаммов микроорганизмов, например флокулирующих, крахмало- и пентозопотребляющих дрожжей и бактерии Zymomonas mobilis. Эти бактерии были выведены в начале ХХ века из пальмового вина и мексиканского напитка. Это палочки, которые значительно меньше дрожжевых клеток, способны расти на питательных средах с высокой концентрацией глюкозы и параллельно образовывать этанол. Они растут в 2 раза быстрее, чем жрожжи, скорость образования этанола в 6-7 раз больше, что предположительно объясняется лучшим транспортом питательных вешществ к маленьким бактериальным клеткам, чем к большим дрожжевым. Выход этанола на 5 % выше., чем у дрожжей, так как эти бактерии тратят меньше сахара для строительства клеточного материала. Бактерии Z. mobilis не нуждаются в кислороде для роста, что значительно облегчает ведение процесса образования этанола, а также можно осуществлять как периодическое, так и непрерывное получение этанола.

Новая технология на стадии сбраживания состоит в применении фиксированных микроорганизмов, а также реакторов петлевого типа в непрерывнодействующем производстве (рис. 13), проведении процесса в аэробных условиях и введении колонн энергетически оптимизированной дистилляции и абсолютизирования через теплообмен и ступенчатое давление в колоннах.

Вторичные метаболиты, называемые также идиолитами, - низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста в чистой культуре Они производятся ограниченным числом таксономических групп и часто представляют собой смесь близкородственных соединений, относящихся к одной и той же химической группе. К вторичным метаболитам относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений и токсины.

Микроорганизмы, производящие вторичные метаболиты, вначале проходят стадию быстрого роста, тропофазу, во время которой синтез вторичных веществ незначителен. По мере замедления роста из-за истощения одного или нескольких необходимых питательных веществ в культуральной среде микроорганизм переходит в идиофазу. Именно в этот период синтезируются идиолиты. В случае антибиотиков большинство микроорганизмов в процессе тропофазы чувствительно к собственным антибтотикам. Однако во время идиофазы они становятся к ним устойчивыми. Чтобы уберечь микроорганизмы, продуцирующие антибиотики, от самоуничтожения, важно быстро достичь идиофазы и затем культивировать микроорганизмы в этой фазе.

Антибиотики - самый большой класс фармацевтических соединений, синтез которых осуществляется микробными клетками. К этому же классу относятся противогрибковые аагенты, противоопухолевые лекарства и алколоиды. В промышленном масштабе наибольшее экономическое значение приобрело производство и сбыт четырех наиболее распространенных групп антибиотиков - пенициллинов, цефалоспоринов, тетрациклинов и эритромицинов.

Шесть родов филаментозных грибов производят около 1000 различных антибиотиков, в том числе цефалоспорины (Cephalosporium) и пенициллины (Penicillium). Два рода нефиламентозных бактерий синтезируют 500 антибиотиков, а три рода актиномицетов - около 3000 антибиотиков. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род Streptomyces, включая тетрациклины (один только вид Streptomyces griseus синтезирует более пятидесяти антибиотиков).

Вторичные метаболиты высших растений - это вырабатываемые клетками химические соединения, не являющиеся их необходимыми компонентами. Сюда не входят аминокислоты, сахара, липиды. Известно около 20 тыс. таких веществ, полученных из растений. Ежегодно открывается около 1600 таких веществ. К вторичным метаболитам, производимым клетками высших растений, относятся лекарственные препараты (стероиды получают из Dioscorea deltoidea, кодеин - Papaver somniferum, атропин - Atropa belladonna, серпентин или резерпин - Ranwolfia serpentina, дигоксин - Digitalus tanata и др.).

К лекарственным веществам близки наркотики (марихуана - из Canabis, опиум и героин - Papaver somniferum, кокаин - Erythroxylon), стимуляторы (кофеин - чай, кофе), яды (рицин - клещевина), инсектициды (перитрин, выделяемый из цветков Chrysanthemum cinerariefolium), ароматобразующие вкусовые вещества, красители.

Весьма перспективным направлением является синтез природных химических соединений с помощью культивирования клеток растений. Культуры клеток можно использовать для синтеза уже известных веществ (кодеина, хинина, пиретрина), синтеза новых продуктов из трудновыращиваемых растений, получение совершенно новых веществ (рутакультин - из Ruta).

Вторичные метаболиты накапливаются в значительных количествах на фазе замедленного роста или в стационарной фазе. Имеется обратная зависимость между ростом клеток и накоплением в них вторичных метболитов. С целью замедления роста клеток прибегают к иммобилизации. Для этого клетки помещают в 2 % агар-агар при 35-40⁰С в гель альгината кальция. Клетки должны выращиваться в тесном контакте друг с другом, приближающем их к состоянию ткани. Клетки необходимо снабжать большим количеством предшественников в низких концентрациях. Предшественники должны быть как можно ближе в цепочке биосинтезов к желаемому продукту. Должны использоваться клетки, секретирующие вторичные метаболиты в питательную среду. Для оптимального выхода метаболитов необходимо проверить различные вариации концентраций и соотношений ауксинов и цитокининов.

Контрольные вопросы

1. Приведите примеры промышленных биотехнологических производств, основанных на синтезе вторичных метаболитов.

2. Основы технологических приемов и параметры производственного процесса. Ограничивающие факторы производства.

Литература

1. Биотехнология: Учебное пособие для вузов в 8 книгах. Под ред. Егорова Н. С., Самуилова В. М. – М: Высшая школа, 1987. С. 1 – 1194.

2. Грачева И. М., Иванова Л. А., Кантере В. М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия. М., Колос, 1992. С. 1 – 383

3. Основы сельскохозяйственной биотехнологии М., Колос, 1999 г. С. 1 – 380.