Лекция 3. Методы биотехнологии

Лекция 6.

Вопросы. 1. Методы разрушения клеток. 2. Отделение, очистка и концентрирование продукта. 3. Принципы действия и конструкции биореакторов.

Методы биотехнологии. Для получения высокоактивных продуктов используют методы селекции. С помощью селекции получены промышленные штаммы микроорганизмов, синтетическая активность которых превышает активность исходных штаммов в десятки и сотни раз.

Селекция – направленный отбор мутантов (организмов, наследственность которых претерпела скачкообразное изменение). Генеральный путь селекции – переход от простого отбора продуцентов к сознательному конструированию их геномов. На каждом из этапов из популяции микроорганизмов отбираются наиболее высокоэффективные клоны. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовые, рентгеновские лучи, химические соединения, вызывающие изменения первичной структуры ДНК.

Генетическая инженерия – направленная модификация биообъектов в результате введения искусственно созданных генетических программ.

Уровни генетической инженерии:

1). Генная -манипулирование участками ДНК, включающими отдельные гены.

2). Хромосомная – манипулирование с группами генов или отдельными хромосомами.

3). Геномная (клеточная) – перенос всего или большей части генетического материала от одной клетки к другой (клеточная инженерия).

Работа в области генетической инженерии включает 4 этапа: 1) получение нужного гена; 2) встраивание его в вектор, способный к репликации; 3) введение гена с помощью вектора в организм;4) питание и селекция клеток, которые приобрели желаемый ген.

Генетическая инженерия высших растений осуществляется на клеточном, тканевым и организменном уровне. Основой клеточной инженерии является гибридизация соматических клеток – слияние неполовых клеток с образованием единого целого. Слияние клеток может быть полным или с введением их отдельных частей (митохондрий, хлоропластов и т.д.).

Соматическая гибридизация позволяет скрещивать генетически отдаленные организмы. Растительные, грибные и бактериальные клетки перед слиянием освобождают от клеточной стенки и получают протопласты. Затем проводят деполяризацию наружных цитоплазматических мембран переменным электрическим или магнитным полем, используют катионы Ca⁺⁺.Клеточную стенку подвергают ферментативному гидролизу.

Методы хранения посевного материала. При промышленном культивирование клеток в биореакторах идет процесс постепенного вытеснения менее приспособленных форм более приспособленными, часто менее продуктивными по отношению к вырабатываемым веществам. Он получил название автоселекции. В связи с этим встает проблема длительного хранения клеток без утраты ценных свойств. Это возможно, если резко затормозить все протекающие в них жизненные процессы. Существуют следующие методы хранения:

1.   Лиофильное высушивание (обезвоживание после замораживания при температуре –40 – 60⁰С и ниже). Применяется в отношении продуцентов антибиотиков.

2.   Высушивание на воздухе в стерильной среде (на почве, бумаге, дисках агар – агара и т.д.).

3.   Сохранение спор (пригоден для спорообразующих бактерий рода Bacillus).

4.   Криоконсервация – глубокое замораживание клеток с их последующим хранением в жидком азоте (- 196⁰С) или в парах азота (– 155).

Значительные трудности представляет поддержание сред, оборудования, воздуха в стерильном состоянии. Это необходимо для исключения попадания в биоректоры посторонних микроорганизмов. Клетки лучше сохраняют свои свойства при создании щадящих условий в биореакторе, приближенных к условиям в лабораторном культиваторе.

Выделение целевого продукта. Это завершающая стадия биотехнологического процесса. Продукт может накапливаться в клетке или выделятся в культуральную жидкость. Наиболее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от культуральной жидкости, разрушить, затем целевой продукт очистить от массы компонентов разрушенных клеток. Первым этапом на пути к очистке целевого продукта является:

1).Отделение биомассы от культуральной жидкости – сепарация. Виды:

1. Флотация. Жидкость предварительно вспенивают, затем отделяют ее верхний слой с клетками.

2.  Фильтрация – задержание биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Применяют фильтры однократного или многократно использования.

3.  Центрифугирование – осаждение взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Требует дорогостоящего оборудования.

2).Разрушение клеток, которое проводят физическим, химическим и химико–ферментативным методами.

Физическое разрушение проводят ультразвуком, с помощью вращающихся лопастей или вибраторов, встряхиванием со стеклянными бусами, продавливанием под высоким давлением через узкое отверстие, раздавливанием замороженной массы, растиранием в струнке, осмотическим шоком, замораживанием – оттаиванием, сжатием с последующим резким снижением давления.

Химическое и химико – ферментативное разрушение клеток избирательно, не всегда пригодно. Его проводят обработкой клеток толуолом или бутанолом. Эффективный лизис вызывают антибиотики. Разрушенные клеточные стенки отделяют методами сепарации.

3). Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или гомогената разрушенных кислот проводят путем его осаждения, экстракции или адсорбции.

1.Осаждение растворенных веществ возможно физическими (нагревание, охлаждения, разбавление или концентрирование раствора) или химическими методами, переводящими отделяемый продукт в малорастворимое состояние. Так, пенициллин переводят в кристаллический осадок в присутствии соединений калия или натрия. Белки осаждают добавлением сульфата аммония, органических растворителей.

2.Экстракция – извлечение продукта из твердого (твердо–жидкофазная) или жидкого (жидко–жидкофазная) образца. К твердо–жидкофазной экстракции относится обливание образца водой, жидко–жидкофазной – добавление органических растворителей. Вторым методом можно извлекать антибиотик, витамины, липиды, гидрофобные белки.

3.Адсорбция – частный случай экстракции, при котором экстрагирующим веществом является твердое тело. Хорошими адсорбентами являются древесный уголь, глины.

К современным методам разделения веществ, основанным на принципах экстракции и адсорбции, относятся хроматография, электрофорез, изотахофорез, электрофокусировка.

При хроматографии разделяемая смесь вводится в контакт с подвижной (растворитель) и неподвижной (бумага, твердый адсорбент) фазой. При электрофорезе разделяемую смесь помещают в мощное электрическое поле, приводящее в движение ионы. При электрофокусировке меняют степень ионизации.