Санитарно-показательные микроорганизмы почвы.

К санитарно-показательным микроорганизмам, которые определяют в почве, относятся БГКП, Clostridium perfringens, термофильные и нитрифицирующие бактерии (табл. 8).

По количеству БГКП судят о фекальном загрязнении почвы и о наличии прочих энтеробактерий. Важным критерием санитарного состояния почвы и ее способности к самоочищению является содержание Clostridium perfringens. Эти микроорганизмы свидетельствуют о фекальном загрязнении, при этом эшерихии исчезают уже через 4—5 мес, а клостридий обнаруживают в титре 0,01 г. Определение термофильных бактерий помогает оценить загрязнение почвы навозом, компостом или сточными водами и

стадию разложения их органического субстрата. Появление нитрифицирующих бактерий указывает на развитие процесса самоочищения. Для более полной оценки процесса самоочищения определяют также группы микроорганизмов, быстро разрушающих органический субстрат: бациллы, актиномицеты, грибы.

Таблица 8. Требования к микробиологической чистоте почв

При попадании в почву органических веществ сразу же повышается общее микробное число (ОМЧ), а также общее число сапрофитов (ОЧС). Обычно в грязных почвах ОМЧ>ОЧС, а в чистых ОМЧ = ОЧС или ОМЧ<ОЧС. Сначала размножаются гетеротрофы, обладающие очень высокой ферментативной активностью и представленные семейством псевдомонад, аэромонад и др. В этот период в почве много фекальных бактерий (БГКП, энтерококки, Cl. perfringens), протеолитов, разлагающих белки, пептоны, аммонификаторов (микробов, расщепляющих белки до NH₃). Для самого свежего загрязнения характерна большая обсемененность почвы энтерококками, БГКП, Cl. perfringens, термофилами и отсутствие нитрификаторов.

В процессе самоочищения почвы состав микрофлоры меняется. По мере повышения кислотности в почве появляются ацидофильные микроорганизмы: молочнокислые бактерии, дрожжи, грибы, плесени, актиномицеты. По мере накопления аммиака в почве начинают размножаться нитрификаторы, т. е. микроорганизмы, окисляющие МН₃ до нитритов и

нитратов. Эти микроорганизмы завершают цикл превращений органических веществ в неорганические. За окисление NH₃ до HNO₂ ответственны нитрозобактерии (Nitrosomonas), а за окисление HNO₂ в HNO₃ — нитробактерии (Nitrobacter). Одновременно с процессами нитрификации идут процессы денитрификации, т.е. восстановление нитратов в нитриты, а далее в газообразный азот. На этом этапе ОМЧ почвы становится низким. Видовой состав и численность микрофлоры стабилизируется. Активные вегетативные формы спорообразующих бактерий и грибов уступают покоящимся спорам бацилл, актиномицетам, грибам. В чистых почвах всегда доминируют покоящиеся споры. Спорообразование всегда говорит о законченных процессах минерализации почвы.

Сочетание ОМЧ и нитрификаторов используют для распознавания и отличия чистых почв от почв, бывших загрязненными, но находящихся на стадии минерализации. Для них характерно низкое ОМЧ, но высокое число нитрификаторов. То же самое можно сказать и при сопоставлении общего числа сапрофитов и процентов споровых аэробов. Если процент споровых форм к ОЧС высок (40—60%), то это характерно для чистых почв, если же низок (25%), то почва загрязнена.

Отбор и подготовка проб.

Перед отбором пробы заполняют сопроводительные документы с описанием местности (характер рельефа, растительности и т.д.), предполагаемых источников загрязнения. Пробы отбирают с прямоугольного участка размером не менее чем 5 х 5 м из 5 точек («метод конверта»). При этом в условиях асептики берут с глубины 20—25 см образцы для приготовления смешанной пробы весом 1 кг.

Пробу помещают в стерильную посуду, маркируют. Исследование пробы желательно проводить в тот же день, допускается хранение материала в течение 24 часов при температуре 4-5ºС.

Перед исследованием образцы почвы освобождают от крупных включений, растирают в ступке и просеивают через стерильное сито с

диаметром пор 3 мм. Масса навесок для исследования зависит от цели исследования. Навеску почвы помещают в стерильную колбу и заливают стерильной водопроводной водой в соотношении 1:10. Полученную смесь встряхивают 10-15 мин, затем 2-3 мин. отстаивают. Полученную суспензию используют для приготовления последующих разведений.

Определение ОМЧ.

ОМЧ почвы определяют глубинным посевом (на плотной среде) из 10- кратных разведений или методом прямой микроскопии (по Перфильеву).

Для глубинного посева готовят несколько разведений почвенной суспензии (10^-2, 10^-3, 10^-4 и т.д.) Для посева выбирают разведения исходя из загрязненности почвы. По 0,1 мл выбранных разведений смешивают с 40 мл расплавленного и остуженного до 45ºС питательного агара, после чего выливают вторым слоем в чашки Петри с питательным агаром. Посевы инкубируют при 28-30ºС в течение 72 часов и подсчитывают количество выросших колоний. Для подсчета колоний выбирают такие разведения почвенной суспензии, при которых на чашках вырастает от 50 до 150 колоний. Затем делают пересчет на 1 г почвы с учетом разведений.

При использовании прямого метода по Б.В. Перьфильеву к 1 мл почвенной суспензии в разведении 1:10 добавляют 1-2 капли раствора акридинового оранжевого. Затем каплю суспензии помещают в капиллярную камеру. Капилляр помещают на предметное стекло, фиксируют парафином и исследуют при помощи люминесцентной микроскопии. Затем делают пересчет на 1 г почвы.

Определение коли-индекса.

Если предполагается невысокая степень фекального загрязнения, БГКП в почве определяют бродильным методом или методом мембранных фильтров; при высокой степени — прямым посевом почвенной суспензии в разведении 1:10 на среду Эндо.

Метод мембранных фильтров проводят также как и при исследовании воды. Предварительно почвенную суспензию 1:10 центрифугируют при 2000

об/мин в течение 5 мин, затем 5-10 мл суспензии фильтруют через мембранные фильтры.

При титрационном методе из приготовленных разведений почвенной суспензии делают посевы в питательную среду Кесслера (1% пептона, 5% желчи, 0,25% лактозы, генциановый фиолетовый). Из разведения 1:10 10 мл засевают во флакон с 50 мл среды, что соответствует 1 г почвы. Для посева меньших количеств (0,1 и 0,01 г почвы) делают разведение 1:100 и по 1 мл из разведений 1:10 и 1:100 соответственно засевают в пробирки с 9 мл среды. Далее методика соответствует определению коли-индекса воды.